Name: super-resolution imaging of the bacterial division machinery
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00
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권한 부여 : 5RO1GM086447-02.

1. 샘플 준비 <ol><li> 변형 JB281의 단일 식민지로 LB 미디어의 예방 [BW25113 / pJB042 (P 라크 : FtsZ-mEos2)]. 37 흔드는에서 하루 아침에 성장 ° C. </li><li> M9에 ​​문화 1:1,000 + 최소한의 미디어 [M9 소금, 0.4 % 포도당, 2 MM MgSO 4, 0.1 MM CaCl 2, 가상 아미노산과 비타민]를 희석 중순 로그 단계 (= 0.2-0.3 OD 600)로 성장 실온 (RT)에서 chloramphenicol (150 μg / ML)의 존재 인치 </li><li> 2...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

PALM 이미지는 다른 방법으로 달성하기 어려운 목표 단백질 분자의 분포와 배열에 대한 자세한 분석을 수 있도록 분자 수와 세포 내 위치에 대한 정보가 들어 있습니다. 다음은 PALM 이미지의 생물학적 관련성을 유지하면서 정확한 정량적 정보를 추출하기 위해 이동해야합니다주의 사항을 설명합니다. 우리는 또한 최고의 라이브 대 고정 셀을 사용하여 얻을 수있는 정보를 탐색. 마지막으로, 우리?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 50 X 가상 아미노산 </td><td> 시그마 </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 가상 비타민 100 X </td><td> 시그마 </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102 - RF </td><td></td></tr><tr><td> 16 % Paraformaldehyde </td><td> 전자 Micrsocopy 과학 </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG 아가로 오스 </td><td> Lonzo </td><td> 50,111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 나노 미터 골드 비즈 </td><td> 마이크로 - Nanospheres </td><td> 790113-010 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 이미징 상공 회의소 </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 무대 어댑터 </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> 역 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1.45 NA, 60x 목표 </td><td> 하늘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD 카메라 </td><td> ANDOR 기술 </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm의 사파이어 레이저 </td><td> 응집성의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm의 사파이어 레이저 </td><td> 응집성의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405 - 나노 미터 CUBE 레이저 </td><td> 응집성의 </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

박테리아 세포 분열이 midcell 1,2에서 열 개 이상의 필수 단백질의 조율 조립이 필요합니다. 이 과정의 중심은 부문 계획 3,4에서 FtsZ 단백질의 링과 같은 suprastructure (Z-링)의 형성이다. Z-링은 여러 단일 좌초 FtsZ의 protofilaments로 구성되어 있으며, Z-링 안쪽에 protofilaments의 배열을 이해하는 것은 힘 발전기 5,6 등 Z-링 조립 및 기능의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 이 정보는 기존의 형광 현미경과 전자 현미경에 의한 전류 제한에 어려운 남아있다. 종래의 형광 현미경은 빛의 회절 한계 (~ 200 nm 정도)에 의한 Z-링의 고해상도 이미지를 제공 할 수 없습니다. 전자 cryotomographic 영상은 작은 C.에 FtsZ의 protofilaments을 분산 감지했습니다 crescentus 세포 7 만 같은 큰 전지에 적용하기 어려운대장균 또는 B. subtilis. 다음은 슈퍼 해상도 형광 현미경 방법의 응용 프로그램을 설명, Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)는 양적 E.의 구조적 조직을 특징하는 대장균 Z-링 8. PALM 이미지가 모두 높은 공간 해상도 (~ 35 nm 정도) 및 대상 단백질의 모호 식별을 사용하려면 특정 레이블을 제공합니다. 우리는 405 nm의 9시에 활성화에 붉은 색 형광 (여기 = 561 nm의)에 녹색 형광 (여기 = 488 나노 미터)에서 전환 photoactivatable 형광 단백질 mEos2과 FtsZ을 표시. PALM의 실험이 진행되는 동안, 단일 FtsZ-mEos2 분자 stochastically 활성화되고 단일 분자의 해당 중심 위치는 &lt;20 나노 미터 정밀도로 결정됩니다. Z-링의 슈퍼 해상도 이미지가 검색된 모든 FtsZ - mEos2 분자의 중심 위치를 중첩에 의해 재건되어 있습니다. &lt;P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;이 방법을 사용하여, 우리는 Z-반지 ~ 100 nm의 고정 폭을 가지고 있으며 가로, 세로, 높이로 서로 겹쳐 FtsZ의 protofilaments의 느슨한 번들로 구성되어있는 것으로 나타났습니다. 이 데이터는 Z-링 (10)의 세포주기에 의존 변경의 추가 조사를위한 발판을 제공하고 관심을 다른 단백질에 적용 할 수 있습니다.

위에 설명 된 PALM 이미징 메서드에서 생성 된 Z-링의 2 차원, 슈퍼 해상도 렌더링은 그림 3Aiv에 도시. 아래에, 우리는 그들로부터 얻을 수 질적 및 양적 정보를 요약. 질적, 우리는 Z-반지 종래의 형광 이미지 (그림 3A-Dii와 IV를 비교)의 구별없는 여러 구성 (싱글 밴드 또는 나선형 아크) 채택 불규칙한 구조입니다 관찰했다. 다음과 같은 관찰은 특정 구조...

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

최적화 STORM 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

연구

생물학

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

크로마뇽을 이용한 초분해능 생물학적 이미징 시대의 3D 색채 시프트의 고정밀 교정

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

세균성 떼의 시간 경과 이미징 및 집단 스트레스 반응

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...