Name: super-resolution imaging of the bacterial division machinery
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Grant: 5RO1GM086447-02.

1. Prøvepreparering <ol><li> Inokuler LB media med en enkelt koloni av stamme JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Vokse over natten i en shaker ved 37 ° C. </li><li> Fortynne kulturen 1:1.000 inn M9 + minimal media [M9 salter, 0,4% glukose, 2 mM MgSo4, 0,1 mm 2 CaCl, MEM aminosyrer og vitaminer] og vokse til midten log fase (OD 600 = 0,2 til 0,3) i nærvær av kloramfenikol (150 ug / ml) ved romtemperatur (RT). </li><li> Fremkall kultur med 20 mikromet...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

PALM bildene inneholder informasjon om molekyl teller og stillinger innenfor en celle, slik at detaljert analyse av fordelingen og arrangement av target proteinmolekyler som er vanskelig å oppnå på annen måte. Nedenfor skisserer vi forholdsregler som bør tas for å trekke nøyaktig kvantitativ informasjon og samtidig opprettholde det biologiske relevansen av PALM bilder. Vi har også utforske informasjon som kan være best oppnås ved hjelp av levende vs fast celler. Endelig foreslår vi veier for å skaffe ekstra ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / Material </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 50 x MEM aminosyrer </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM Vitaminer </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% paraformaldehyd </td><td> Electron Micrsocopy Sciences </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG Agarose </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm Gull Perler </td><td> Mikrosfærer-nanospheres </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Imaging Chamber </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stage Adaptor </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Inverted Microscope </td><td> Olympus </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1,45 NA, 60x Mål </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Kamera </td><td> Andor Technology </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm Sapphire Laser </td><td> Samstemt </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Sapphire Laser </td><td> Samstemt </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm CUBE Laser </td><td> Samstemt </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

Bakteriell celledeling krever koordinert montering av mer enn ti viktige proteiner på midcell 1,2. Sentralt i denne prosessen er dannelsen av en ring-lignende suprastructure (Z-ringen) av FtsZ protein ved divisjonen planen 3,4. Z-ringen består av flere enkelt-trådede FtsZ protofilamenter, og forstå arrangementet av protofilamenter inni Z-ringen vil gi innsikt i mekanismen av Z-ringen montering og dets funksjon som en kraft generator 5,6. Denne informasjonen har vært unnvikende på grunn av gjeldende begrensninger i konvensjonell fluorescens mikroskopi og elektronmikroskopi. Konvensjonell fluorescensmikroskopi er stand til å gi et bilde med høy oppløsning av Z-ringen på grunn av diffraksjon grensen av lys (~ 200 nm). Elektron cryotomographic bildebehandling har oppdaget spredt FtsZ protofilamenter i små C. crescentus celler 7, men er vanskelig å anvende på større celler somE. coli eller B. subtilis. Her beskriver vi anvendelse av en super-oppløsning fluorescensmikroskopi metoden, Photoactivated Localization Mikroskopi (PALM) kvantitativt karakterisere strukturelle organisering av E. coli Z-ring 8. PALM bildebehandling tilbyr både høy romlig oppløsning (~ 35 nm) og spesifikk merking for å aktivere entydig identifisering av mål proteiner. Vi merket FtsZ med photoactivatable fluorescerende protein mEos2, som skifter fra grønt fluorescens (eksitasjon = 488 nm) til rødt fluorescens (eksitasjon = 561 nm) ved aktivering ved 405 nm 9. Under en PALM eksperiment, er enkle FtsZ-mEos2 molekyler stokastisk aktivert og de tilsvarende Tyngdepunktet posisjonene til de enkle molekyler er bestemt med &lt;20 nm presisjon. En super-oppløsning av Z-ringen blir deretter rekonstruert av superimposing sentroiden posisjonene alle oppdagede FtsZ-mEos2 molekyler. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Ved hjelp av denne metoden, har vi funnet at Z-ringen har en fast bredde på ~ 100 nm, og er sammensatt av en løs samling av FtsZ protofilamenter som overlapper med hverandre i tre dimensjoner. Disse dataene gir et utgangspunkt for videre undersøkelser av cellesyklusen avhengige endringer av Z-ringen 10 og kan anvendes for andre proteiner av interesse.

Illustrert i fig 3Aiv er en to-dimensjonal, super-oppløsning gjengivelse av Z-ringen som genereres fra PALM avbildningsmetode beskrevet ovenfor. Nedenfor oppsummerer vi kvalitativ og kvantitativ informasjon som kan hentes fra dem. Kvalitativt, observerte vi at Z-ringen er en uregelmessig struktur som vedtar flere konfigurasjoner (enkelt band eller spiralformede bue) som ikke kan skilles i konvensjonelle fluorescens bilder (sammenlign figur 3A-Dii og <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Vi beskriver en super-oppløsning avbildningsmetode å sondere strukturelle organisering av den bakterielle FtsZ-ringen, en essensiell apparat for celledeling. Denne metoden er basert på kvantitative analyser av photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) bilder og kan brukes til andre bakterielle cytoskeletal proteiner.

Super-oppløsning Imaging av Bakteriell divisjon Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Test Prøver for Optimalisere STORM Super-oppløsning Mikros

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøvepreparering for mikroskopi av enkeltvirionakroskopi og superoppløselig fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-Resolution Imaging av Cytokinetic Z Ring i levende bakterier Bruke Fast 3D-Strukturert Illumination Mikros (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Forberedelse, Imaging, og Kvantifisering av Bakteriell Surface Motility Analyser

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tredimensjonal Super Resolution Mikroskopi av F-aktin filamenter av Interferometric PhotoActivated Lokalisering Mikroskopi (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Bakken staten uttømming super-oppløsning Imaging i pattedyrceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Anvendelse av høyhastighets super-oppløsning hastighet mikroskopi i Live primære Flimmerhår

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Høy nøyaktighet korreksjon av 3D kromatiske skift i en alder av super-oppløsning biologisk bildebehandling ved hjelp av chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Time-lapse Imaging av bakterielle svermer og kollektiv stressrespons

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...