Name: super-resolution imaging of the bacterial division machinery
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Грант: 5RO1GM086447-02.

1. Подготовка проб <ol><li> Инокулировать LB среды с одной колонии штамма JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Вырасти на ночь в шейкере при 37 ° C. </li><li> Развести культуры 1:1000 в M9 + минимальных средах [M9 соли, 0,4% глюкозы, 2 мМ MgSO 4, 0,1 мМ CaCl 2, MEM аминокислот и витаминов] и расти до середин...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

PALM изображения содержат информацию о молекуле счета и позиции внутри клетки, что позволяет детальный анализ распределения и расположения молекул белка-мишени, которую трудно достичь другими средствами. Ниже мы приводим меры предосторожности, которые должны быть приняты для извлечен?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название Реагенты / Материал </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 50 х MEM Аминокислоты </td><td> Сигма </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 х MEM Витамины </td><td> Сигма </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% параформальдегид </td><td> Электрон Micrsocopy наук </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> Легкоплавкий GTG Агароза </td><td> Лонзо </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 нм Бисер Золото </td><td> Микросферы-наносферы </td><td> 790113-010 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 изображений палата </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Этап адаптер </td><td> ASI </td><td> Я-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Инвертационный микроскоп </td><td> Олимп </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1,45 NA, 60x цели </td><td> Олимп </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD камеры </td><td> Андор технологии </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-нм сапфирового лазера </td><td> Когерентный </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-нм сапфирового лазера </td><td> Когерентный </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-нм лазерный CUBE </td><td> Когерентный </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

Бактериальные деления клеток требует скоординированных сборки из более чем десяти основных белков в midcell 1,2. Центральное место в этом процессе является формирование кольцевых супраструктуры (Z-кольцо) белком FtsZ в плане разделения 3,4. Z-кольцо состоит из нескольких одноцепочечной протофиламентов FtsZ, и понимание расположения протофиламентов внутри Z-кольцо обеспечит понимание механизма Z-кольцо в сборе и его функции как сила, генератор 5,6. Эта информация осталась неуловимой из-за существующих ограничений в обычной флуоресцентной микроскопии и электронной микроскопии. Обычные флуоресцентной микроскопии не в состоянии обеспечить высокое разрешение изображения Z-кольцо из-за дифракционного предела света (~ 200 нм). Электрон cryotomographic изображений обнаружено разбросаны FtsZ протофиламентов в небольших C. crescentus клеток 7, но трудно применять на больших клетках, таких какE.coli или B. Сенная. Здесь мы описываем применение супер-разрешение флуоресцентного метода микроскопии, фотоактивированного микроскопии локализации (PALM), количественно характеризующие структурную организацию E. палочки Z-кольцо 8. PALM изображений предлагает как высоким пространственным разрешением (~ 35 нм) и конкретные маркировки чтобы однозначной идентификации белков-мишеней. Мы назвали FtsZ с фотоактивируемых флуоресцентного белка mEos2, который переключается с зеленой флуоресценции (возбуждение = 488 нм) до красной флуоресценции (возбуждение = 561 нм) при активации при 405 нм 9. Во время эксперимента PALM, одна FtsZ-mEos2 молекул стохастически активируется и соответствующая тяжести положения отдельных молекул определяется с &lt;20 нм точность. Супер-разрешение изображения Z-кольцо, затем реконструирован путем наложения тяжести позиций всех обнаруженных FtsZ-mEos2 молекул. &lt;р = класса &quot;jove_content&quot;&gt; Используя этот метод, мы обнаружили, что Z-кольцо имеет фиксированную ширину ~ 100 нм и состоит из свободных расслоение протофиламентов FtsZ, которые перекрывают друг с другом в трех измерениях. Эти данные служат трамплином для дальнейших исследований клеточного цикла зависимости изменения Z-кольцо 10 и может быть применен к другим белкам интерес.

Показано на рисунке 3Aiv является двумерным, супер-разрешение рендеринга Z-кольцо, порожденное от метода PALM изображениями описанное выше. Ниже мы кратко качественную и количественную информацию, которая может быть получена от них. Качественно, мы обнаружили, что ...

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Мы описываем супер-разрешение изображения методом для исследования структурной организации бактериальных FtsZ-кольцо, существенную устройство для деления клеток. Этот метод основан на количественном анализе фотоактивированного локализации микроскопии (PALM) изображений и может быть применен в других бактериальных белков цитоскелета.

Super-Resolution Imaging бактериального Машины отдела

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Опытные образцы для оптимизации STORM супер-разрешения микроскопии

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Подготовка образцов для одной микроскопии атомной силы Virion и флуоресценции супер-разрешения

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Супер-Resolution Imaging из Cytokinetic Z Кольцо в живых бактерий Использование быстрого 3D-Structured Illumination микроскопии (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Подготовка, Imaging, и количественное определение бактериальной поверхности моторики Анализы

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Трехмерная Суперразрешение Микроскопия F-актин филаментов интерферометрической фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Основного состояния истощения суперразрешением изображений в клетках млекопитающих

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Применение высокоскоростных суперразрешением скорость микроскопии в прямом первичной ресничку

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Высокот точность коррекции 3D Хроматические сдвиги в эпоху супер-разрешение биологического изображения с использованием Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Временное изображение бактериальных роев и коллективный стресс ответ

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...