Name: super-resolution imaging of the bacterial division machinery
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Grant: 5RO1GM086447-02.

1. Provberedning <ol><li> Inokulera LB medium med en enda koloni av stam JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Odla över natten i en skakapparat vid 37 ° C. </li><li> Späd kulturen 1:1000 i M9 + minimala media [M9 Salter, 0,4% glukos, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, MEM aminosyror och vitaminer] och växa till mitten av log-fasen (OD 600 = 0,2-0,3) i närvaro av kloramfenikol (150 | ig / ml) vid rumstemperatur (RT). </li><li> Inducera kultur med 20 M IPTG u...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

PALM bilder innehåller information om molekyl räknas och befattningar inom en cell, så detaljerad analys av spridning och arrangemanget av molekyler målprotein som är svår att uppnå på annat sätt. Nedan redogör vi försiktighetsåtgärder som bör vidtas för att extrahera exakt kvantitativ information samtidigt som biologisk relevans PALM bilder. Vi utforskar också den information som kan bäst erhållas med levande kontra fasta celler. Slutligen föreslår vi vägar för att erhålla ytterligare super-uppl?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / material </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 50 x MEM Aminosyror </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM Vitaminer </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td> Electron Micrsocopy Sciences </td><td> 15.710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG agaros </td><td> Lonzo </td><td> 50.111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm Guld Pärlor </td><td> Mikrosfärer-nanosfärer </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Imaging avdelningen </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Steg Adapter </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Inverterat mikroskop </td><td> Olympus </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1,45 NA, 60x Mål </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD kamera </td><td> Andor Technology </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm Sapphire laser </td><td> Sammanhängande </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Sapphire laser </td><td> Sammanhängande </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm CUBE Laser </td><td> Sammanhängande </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

Bakteriell celldelning kräver samordnade montering av mer än tio viktiga proteiner vid midcell 1,2. Centralt för denna process är bildandet av en ringliknande suprastructure (Z-ring) av FtsZ protein vid delningsplanen 3,4. Z-ringen består av flera enkelsträngade FtsZ protofilament, och förstå arrangemanget av protofilament inuti Z-ringen kommer att ge insikt i mekanismen av Z-ringenheten och dess funktion som en kraft generator 5,6. Denna information har varit svårfångade på grund av rådande begränsningar i konventionell fluorescensmikroskopi och elektronmikroskopi. Konventionell fluorescensmikroskopi inte kan tillhandahålla en högupplöst bild av Z-ringen på grund av diffraktionsgränsen ljus (~ 200 nm). Elektron cryotomographic avbildning har upptäckt spridda FtsZ protofilament i små C. crescentus celler 7, men är svår att tillämpa på större celler såsomE. coli eller B. subtilis. Här beskriver vi tillämpningen av en super-upplösning fluorescensmikroskopi metod för fotoaktiverade Lokalisering Mikroskopi (PALM), karakterisera kvantitativt den strukturella organisationen av E. E. coli Z-ringen 8. PALM avbildning erbjuder både hög rumslig upplösning (~ 35 nm) och särskild märkning för att möjliggöra entydig identifiering av målproteiner. Vi märkt FtsZ med fotoaktiverbara fluorescerande proteinet mEos2, som växlar från grön fluorescens (excitation = 488 nm) till röd fluorescens (excitation = 561 nm) vid aktivering vid 405 nm 9. Under en PALM experiment är enkla FtsZ-mEos2 molekyler stokastiskt aktiveras och motsvarande centroid positioner enstaka molekyler bestäms med &lt;20 nm precision. En super-upplösning av Z-ringen sedan rekonstrueras genom att lägga de centroida positioner alla upptäckta FtsZ-mEos2 molekyler. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Med denna metod fann vi att Z-ringen har en fast bredd på ~ 100 nm och består av en lös bunt av FtsZ protofilament som överlappar varandra i tre dimensioner. Dessa data ger en språngbräda för fortsatta undersökningar av de osjälvständiga cellcykeln förändringar av Z-ringen 10 och kan tillämpas på andra proteiner av intresse.

Illustreras i figur 3Aiv är en tvådimensionell, super-upplösning rendering av Z-ringen genereras från PALM avbildningsmetod beskrivits ovan. Nedan sammanfattar vi kvalitativa och kvantitativa uppgifter som kan erhållas från dem. Kvalitativt, observerade vi att Z-ringen är en oregelbunden struktur som antar flera konfigurationer (enda band eller spiralformad båge) som inte kan särskiljas i konventionella fluorescensbilder (jämför figur 3A-Dii och <...

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Vi beskriver en super-upplösning avbildningsmetod att sondera den strukturella organisationen av bakteriella FtsZ-ringen, en väsentlig anordning för celldelning. Denna metod är baserad på kvantitativa analyser av fotoaktiverade (Palm) lokalisering mikroskopi bilder och kan tillämpas på andra bakteriella cytoskelettproteiner.

Super-upplösning avbildning av de bakteriella Division Maskin

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Test Prover för Optimera STORM Super-resolution Mikroskopi

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-upplösning avbildning av Cytokinetic Z Ring i levande bakterier Använda Snabb 3D-Structured Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Förberedelse, Imaging, och kvantifiering av bakterie Surface Motility Analyser

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tredimensionell Super Resolution mikroskopi av F-aktinfilament av interferometriska photoactivated Lokalisering Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtillståndet utarmning super resolution Imaging i däggdjursceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Tillämpningen av höghastighetståg super-resolution hastighet mikroskopi i levande primära cilier

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Hög noggrannhet korrigering av 3D kromatiska förändringar i en ålder av super-resolution biologisk avbildning med chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Time-lapse Imaging av bakteriell svärmar och collective stressrespons

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...