Name: super-resolution imaging of the bacterial division machinery
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Hibe: 5RO1GM086447-02.

1. Örnek Hazırlanması <ol><li> Suşu JB281 tek bir koloni ile LB ortamı aşılamak [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. 37 bir çalkalayıcı gecede büyümek ° C. </li><li> M9 içine kültür 1:1,000 + asgari medya [M9 Tuzlar,% 0.4 glikoz, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, MEM Amino Asitler ve Vitaminler] seyreltin ve orta-log fazı (= 0.2-0.3 OD 600) büyümek Oda sıcaklığında (RT) de kloramfenikol (150 ug / ml) varlığında. </li><li> 20 uM (Not # 1) 2 saa...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

PALM görüntüleri başka yollarla elde etmek zordur hedef protein moleküllerinin dağılımı ve düzenlenmesi detaylı analizi izin molekül sayısı ve hücre içindeki konumları hakkında bilgi içerir. Aşağıda PALM görüntülerin biyolojik alaka korurken doğru kantitatif bilgileri ayıklamak için alınması gereken önlemler özetlemektedir. Biz de en iyi canlı vs sabit hücreler kullanılarak elde edilebilir bilgileri inceleyebilirsiniz. Son olarak, biz hücre bölünmesi makine hakkında ek süper-çöz...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 50 x MEM Amino Asitler </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Vitaminler 100 x </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> % 16 paraformaldehit </td><td> Elektron Micrsocopy Bilimleri </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG Agaroz </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm Altın Boncuk </td><td> Mikroküreler-nanokürecikler </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Görüntüleme Odası </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sahne Adaptör </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Ters Mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1.45 NA, 60x Amaç </td><td> Olimpos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Kamera </td><td> Andor Teknoloji </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm Safir Lazer </td><td> Tutarlı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Safir Lazer </td><td> Tutarlı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm CUBE Lazer </td><td> Tutarlı </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

Bakteriyel hücre bölünmesi midcell 1,2 de daha on temel proteinin koordineli montaj gerektirir. Bu sürecin temelinde bölünme planı 3,4 de FtsZ protein tarafından bir halka benzeri suprastructure (Z-ring) oluşumudur. Z-halka birden fazla tek sarmallı FtsZ protofilaments oluşur, ve Z-halka içinde protofilaments düzenlemesini anlama bir güç jeneratörü 5,6 olarak Z-halka montaj ve işlevi mekanizma fikir sunar. Bu bilgiler, geleneksel floresan ve elektron mikroskopi nedeniyle mevcut sınırlamalar zor kalmıştır. Geleneksel floresan mikroskobu ışığın kırınım sınırı (~ 200 nm) nedeniyle Z-halkasının bir yüksek çözünürlüklü görüntü sağlayamaz. Elektron cryotomographic görüntüleme küçük C. FtsZ protofilaments dağınık algıladı crescentus 7 hücreleri, ancak bu gibi büyük hücreleri uygulamak zordurE. coli ya da B. subtilis. Burada bir süper-çözünürlük floresans mikroskopi yöntemi uygulama tanımlamak, fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (PALM), kantitatif E. yapısal organizasyonu karakterize etmek coli Z-ring 8. PALM görüntüleme hem yüksek uzaysal çözünürlük (~ 35 nm) ve hedef proteinleri açık olarak tanımlaması sağlamak için özel etiketleme sunmaktadır. Biz 405 nm 9 aktivasyonu üzerine kırmızı floresan (eksitasyon = 561 nm) ve yeşil floresan (eksitasyon = 488 nm) geçer photoactivatable floresan proteini mEos2 ile FtsZ etiketli. Bir hurma deney esnasında, tek FtsZ-mEos2 moleküller stokastik olarak aktive edilir ve tek molekül karşılık gelen pozisyonlarda sentroid &lt;20 nm hassas bir şekilde tespit edilir. Z-halkasının bir süper çözünürlüklü görüntü sonra tüm tespit FtsZ-mEos2 moleküllerin Centroid pozisyonları atma tarafından yeniden yapılmıştır. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu yöntemi kullanarak, biz Z-ring ~ 100 nm sabit bir genişliğe sahip ve üç boyutta birbirleriyle örtüşen FtsZ protofilaments gevşek bir paket oluştuğunu buldu. Bu veriler, Z-halka 10, hücre devre bağımlı değişiklikleri daha ileri araştırmalar için bir sıçrama sağlamak ve ilgili diğer proteinler ile uygulanabilir.

Yukarıda tarif PALM görüntüleme yöntemi üretilen Z-halkanın iki-boyutlu, süper-çözünürlük oluşturmasıdır Şekil 3Aiv &#39;de gösterilmiştir. Aşağıda, onları elde edilebilir nitel ve nicel bilgiyi özetleyebilir. Nitelik, biz Z-ring konvansiyonel floresans görüntüleri (Şekil 3A-Dii ve iv karşılaştırın) olarak ayırt edilemeyen çoklu konfigürasyonlar (tek band veya sarmal yay) benimser düzensiz bir yapıda old...

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bakteriyel Yüzey Motilite Tahliller hazırlanması, Görüntüleme ve miktarının belirlenmesi

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Chromagnon Kullanarak Süper Çözünürlüklü Biyolojik Görüntüleme Çağında 3D Kromatik Değişimlerin Yüksek Doğrulukdüzeltmesi

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Bakteriyel Sürülerin Hızlandırılmış Görüntülemesi ve Kolektif Stres Tepkisi

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...