Name: quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier les Drs Silvia B Campos-Bilderback et George J Rhodes pour l&#39;achèvement des procédures chirurgicales impliquant le placement de lignes d&#39;accès veineux. Ils aimeraient également remercier Sara E sevrage pour maintenir les colonies Munich-Wistar composé de deux Simonsen et souches Frömter.

1. Conjugaison de sérum albumine de rat de sulfo-rhodamine 101 sulfonyle (Texas Red) <ol><li> Dissoudre 100 mg de Rat albumine sérique (RSA) dans 6.667 ml de 100 mM Sodium Bicarbonate pH 9,0; concentration finale de 15 mg / ml dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Lieu solution dans la glace / eau bécher et refroidir à entre 0 et 4 ° C. </li><li> Ajouter 200 pi de qualité diméthylformamide élevé (DMF) anhydre à un flacon de 10 mg de Texas Red sulfonyle (TRSC); vortex sur le milieu pendant 15 sec. </li><li...

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

Les étapes soulignés ici représentent ce que nous croyons être celles qui vont produire des valeurs de perméabilité cohérentes et précises car elles contournent les pièges suivants: <ol><li> Diffusion: L&#39;utilisation d&#39;un dispositif d&#39;émission des fluorophores rouges permettre une collecte plus efficace de la lumière depuis plus photons de longueurs d&#39;onde sont moins enclins à se disperser. En utilisant soit des fluorophores émettant vert ou bleu va introduire une plus grande variation da...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

Les maladies du rein impliquant la perte urinaire de grandes macromolécules essentielles, comme l&#39;albumine sérique, ont longtemps été pensé pour être causés par des altérations de la barrière de perméabilité composé de podocytes, cellules endothéliales vasculaires, et une membrane basale de travail à l&#39;unisson. Les données de notre laboratoire en utilisant intravitale microscopie 2 photons ont révélé une barrière plus perméable de filtration glomérulaire (GFB) qu&#39;on ne le pensait dans des conditions physiologiques, avec récupération des filtré albumine se produisant dans un sous-ensemble au début de cellules appelées cellules des tubules proximaux (PTC) 1,2 3. Les techniques précédentes utilisées pour étudier la filtration rénale et d&#39;établir les caractéristiques de la barrière de filtration impliqué micropuncture de la lumière de ces segments tubulaires début de l&#39;échantillonnage du contenu et analyse 4 fluide. Ces études ont déterminé la concentration d&#39;albumine dans le liquide luminal être pratiquement inexistante; correspondant étroitementpour ce qui est normalement détecté dans l&#39;urine. Cependant, la caractérisation des polymères de dextran avec des tailles définies par cette technique a révélé celles d&#39;une taille similaire à l&#39;albumine sérique des niveaux plus élevés dans la lumière tubulaire et l&#39;urine; suggérant une perméabilité accrue 5. Ce document est un aperçu détaillé de la technique utilisée pour visualiser et quantifier directement glomérulaire fluorescent perméabilité albumine in vivo. Cette méthode permet la détection de l&#39;albumine filtrée à travers la barrière de filtration dans l&#39;espace de Bowman (la chambre initiale de filtration urinaire), et permet également la quantification de l&#39;albumine réabsorption par les tubules proximaux et la visualisation de suite transcytosis albumine 6. L&#39;absence d&#39;albumine fluorescent le long des segments tubulaires plus tard, en route vers la vessie met en évidence l&#39;efficacité de la voie de récupération dans les segments des tubules proximaux plus tôt. De plus, lorsque cette technique a été appliquée pour déterminer la perméabilitéde dextranes ayant une taille similaire à des valeurs de perméabilité pratiquement identiques albumine ont été signalés 2. Ces observations appuient directement la nécessité d&#39;élargir la portée de beaucoup de maladies rénales protéinuriques de modifications incluses dans la remise en état des cellules du tubule proximal.

La figure 3 montre un exemple d&#39;une image prise à partir d&#39;un glomérule de surface d&#39;un Munich Wistar Frömter rat et les mesures prises pour déterminer la perméabilité de l&#39;albumine fluorescente. La valeur CGC de l&#39;albumine de 0,0111 dérivé pour cette glomérule chute individu au sein de la gamme vu dans cette souche de rats Wistar Munich lorsque dans l&#39;état nourri 3. La stabilité observée dans ces images est due à la planification minutieuse et l&#39;exéc...

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Une technique utilisant haute résolution intavital microscopie 2-photons pour visualiser directement et de quantifier filtration gloemrular dans les glomérules de surface. Cette méthode permet la détermination directe des caractéristiques de perméabilité des macromolécules dans des états normaux et malades.

Quantifier glomérulaire perméabilité des macromolécules fluorescentes en microscopie 2 photons à Munich chez le rat Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

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Médecine

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A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

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In Vivo Analyse morphométrique des humains nerfs crâniens à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique oreilles maladie de Menière et des oreilles de l’audition normale

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Mesure très sensible de la perméabilité glomerulaire chez les souris avec fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

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Analyse des enregistrements électrocardiographiques à long terme pour détecter les arythmies chez la souris

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