Name: quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei Dr. Silvia B Campos-Bilderback und George J Rhodes für den Abschluss chirurgische Verfahren, die Platzierung von venösen Zugang Linien danken. Sie möchte auch Sara E Wean für die Aufrechterhaltung der Munich-Wistar Kolonien, bestehend aus den beiden Simonsen und Frömter Stämme danken.

Ein. Konjugation von Rattenserumalbumin zu Sulfo-Rhodamin 101 Sulfonsäurechlorid (Texas Red) <ol><li> Man löst 100 mg Rattenserumalbumin (RSA) in 6.667 ml von 100 mM Natriumhydrogencarbonat pH 9,0; Endkonzentration 15 mg / ml in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Platz Lösung in Eis / Wasser Becherglas und kühl, zwischen 0 bis 4 ° C. </li><li> In 200 ul hochwertigen wasserfreien Dimethylformamid (DMF) zu einer 10 mg-Ampulle von Texas Red Sulfonsäurechlorid (TRSC); Vortex auf Medium für 15 sek. </li><li>...

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

Die Schritte hervorgehoben hier darstellen, was wir diejenigen, die eine konsistente und genaue Durchlässigkeit Werte erzeugen wird, weil sie die folgenden Fallstricke zu umgehen fühlen: <ol><li> Streuung: Die Verwendung eines roten emittierende Fluorophore ermöglichen eine effizientere Sammlung von Leichtverpackungen seit längerer Wellenlänge Photonen weniger anfällig zu streuen sind. Mit entweder grün oder blau emittierende Fluorophore einführen größere Variation in der GSC wegen der erhöhten Variabilit...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

Nierenerkrankungen mit Urin Verlust großer wesentlichen Makromoleküle, wie zB Serumalbumin, sind seit langem vermutlich durch Veränderungen in der Permeabilitätsbarriere podocytes umfasst, vaskuläre Endothelzellen und einer Basalmembran zusammen arbeiten verursacht werden. Daten aus unserem Labor mittels intravitaler 2-Photonen-Mikroskopie zeigte eine durchlässiger glomerulären Filtrationsrate Barriere (GFB) als bisher unter physiologischen Bedingungen haben, mit Abruf von gefilterten Albumin vorkommende in einem frühen Untergruppe von Zellen, die sogenannten proximalen Tubuluszellen (PTC) 1,2, 3. Zurück Techniken verwendet, um Nierenfiltration studieren und zur Gründung der Charakteristik der Filtration Barriere beteiligt micropuncture des Lumen dieser frühen Rohrsegmente mit der Probenahme und Analyse Fluidgehalt 4. Diese Studien bestimmt Albumin-Konzentration in der luminalen Flüssigkeit praktisch nicht existent; entsprechend engzu dem, was in der Regel im Urin nachgewiesen. Allerdings ergab die Charakterisierung von Dextran Polymere mit definierter Größe durch diese Technik die von ähnlicher Größe wie Serumalbumin hatte höheren Ebenen in der röhrenförmigen Lumen und Urin, was darauf hindeutet, erhöhte Durchlässigkeit 5. Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Technik verwendet, um direkt zu visualisieren und quantifizieren glomerulären fluoreszierenden Albumindurchlässigkeit in vivo. Dieses Verfahren ermöglicht die Erkennung von gefilterten Albumin über den Filtrationsbarriere in Bowman-Raum (die erste Kammer des Urin-Filtration) und erlaubt auch die Quantifizierung von Albumin Reabsorption von proximalen Tubuli und Visualisierung der nachfolgenden Albumin Transzytose 6. Das Fehlen von fluoreszierenden Albumin entlang später Rohrsegmente auf dem Weg zu der Blase wie die Effizienz des Abrufs Weg in den früheren proximalen Tubulus-Segmente. Darüber hinaus, um, wenn diese Technik angewendet wurde, bestimmen Permeabilitätvon Dextranen mit einer ähnlichen Größe wie Albumin praktisch identisch Permeabilitäten wurden 2 angegeben. Diese Beobachtungen unterstützen direkt die Notwendigkeit, den Fokus vieler Nierenerkrankungen mit Proteinurie Krankheiten enthalten Änderungen in proximalen Tubulus Zelle Rückgewinnung erweitern.

Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines Bildes von einer Oberfläche eines Glomerulus München Wistar Frömter Ratte und welche Schritte unternommen wurden, um die Durchlässigkeit von fluoreszierenden Albumin bestimmen gemacht. Der GSC Wert für Albumin von 0,0111 für diese einzelnen Glomerulus fallen in den Bereich in dieser Sorte von München Wistar Ratten, wenn in der Fed Zustand 3 gesehen abgeleitet. Die Stabilität in diesen Bildern zu sehen ist auf die sorgfältige Planung und Ausführun...

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Eine Technik, die Verwendung hochauflösende intavital 2-Photonen-Mikroskopie direkt visualisieren und quantifizieren gloemrular Filtration in Oberfläche Glomeruli. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Bestimmung der Durchlässigkeit Eigenschaften von Makromolekülen in normalen und erkrankten Staaten.

Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Research

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Medicine

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