Name: quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Silvia B Campos-Bilderback e George J. Rhodes per il completamento di interventi chirurgici che coinvolgono il posizionamento di linee di accesso venoso. Si vorrebbe anche ringraziare Sara E Wean per mantenere le colonie Monaco-Wistar comprendenti sia Simonsen e ceppi Frömter.

1. Coniugazione di Rat albumina sierica di solfo-rodamina 101 Sulfonyl Cloruro (Texas Red) <ol><li> Sciogliere 100 mg di albumina sierica Rat (RSA) in 6,667 ml di 100 mM Sodio bicarbonato pH 9,0; concentrazione finale di 15 mg / ml in un tubo da 50 ml conica. </li><li> Soluzione luogo in bicchieri di ghiaccio / acqua e raffreddare a tra 0-4 ° C. </li><li> Aggiungere 200 ml di dimetilformammide anidra di alta qualità (DMF) per una fiala 10 mg di Texas Red Sulfonyl Cloruro (TRSC); vortice sul medio per 15 sec. </li><l...

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

I passaggi evidenziati qui rappresentano ciò che sentiamo di essere quelli che producono valori di permeabilità coerenti e precise, perché aggirano i seguenti problemi: <ol><li> Scattering: L&#39;uso di un rosso fluorofori che emettono permetterebbe una maggiore efficienza di raccolta della luce dal più fotoni di lunghezza d&#39;onda sono meno inclini a disperdersi. Utilizzando sia fluorofori che emettono verdi o blu introdurrà maggiore variazione in GSC della causa della maggiore variabilità nei valori di int...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

Malattie renali con perdita urinaria di grandi macromolecole essenziali, quali albumina sierica, sono stati a lungo pensato per essere causato da alterazioni nella permeabilità della barriera composto podociti, cellule endoteliali vascolari, e una membrana basale lavorano all&#39;unisono. I dati ottenuti nel nostro laboratorio utilizzando intravital microscopia a 2 fotoni rivelato una più permeabile barriera di filtrazione glomerulare (ULA) di quanto si pensasse in condizioni fisiologiche, con il recupero di filtrato albumina che si verificano in un sottoinsieme precoce di cellule chiamate cellule del tubulo prossimale (PTC) 1,2, 3. Tecniche precedenti usate per studiare filtrazione renale e stabilendo la caratteristica della barriera di filtrazione coinvolto micropuntura del lume di questi segmenti tubolari primi con campionamento del fluido contenuto e analisi 4. Questi studi determinata concentrazione di albumina nel fluido luminale essere praticamente inesistenti; corrispondente strettamentea quanto normalmente rilevata nelle urine. Tuttavia, la caratterizzazione dei polimeri di destrano con dimensioni definite da questa tecnica ha rivelato quelle di dimensioni simili all&#39;albumina sierica avevano livelli più elevati nel lume tubulare e nelle urine; suggerendo un aumento della permeabilità 5. Qui è una descrizione dettagliata della tecnica utilizzata per visualizzare direttamente e quantificare glomerulare fluorescente permeabilità albumina in vivo. Questo metodo permette di individuare filtrata albumina attraverso la barriera di filtrazione nello spazio di Bowman (la camera iniziale di filtrazione urinaria), e permette anche la quantificazione di albumina riassorbimento dai tubuli prossimali e visualizzazione di successiva transcitosi albumina 6. L&#39;assenza di fluorescenza lungo albumina successivi segmenti tubolari in rotta alla vescica evidenzia l&#39;efficienza del percorso di recupero nei segmenti tubulo prossimale precedenza. Inoltre, quando è stata applicata questa tecnica per determinare la permeabilitàdi destrani aventi dimensioni simili a valori di permeabilità praticamente identiche albumina sono stati segnalati 2. Queste osservazioni supportano direttamente la necessità di ampliare l&#39;attenzione di molte malattie renali proteinuriche ai inclusi alterazioni delle cellule del tubulo prossimale bonifica.

La figura 3 mostra un esempio di immagine presa da un glomerulo superficie di un Munich Wistar Frömter ratto e le misure adottate per determinare la permeabilità di albumina fluorescente. Il valore GSC per l&#39;albumina di 0,0111 derivato per questo autunno glomerulo individuo all&#39;interno del campo visto in questo ceppo di Monaco ratti Wistar quando nella condizione alimentato 3. La stabilità visto in queste immagini è dovuta alla accurata progettazione e l&#39;esecuzione di istruzio...

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Una tecnica che utilizza alta risoluzione intavital microscopia a 2 fotoni di visualizzare direttamente e quantificare filtrazione gloemrular in glomeruli superficie. Questo metodo consente la determinazione diretta di caratteristiche di permeabilità di macromolecole in stati sia normali e malati.

Quantificare permeabilità glomerulare delle Macromolecole fluorescenti usando la microscopia a due fotoni a Monaco di Baviera ratti Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

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