Name: quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Silvia B Campos-Bilderback och George J Rhodos för att slutföra kirurgiska ingrepp som omfattar placering av linjer venös tillgång. De skulle också vilja tacka Sara E avvänja för att upprätthålla de Munich-Wistar kolonier bestående av både Simonsen och Frömter stammar.

Ett. Konjugering av råttserumalbumin till Sulfo-Rodamin 101 sulfonylklorid (Texas Red) <ol><li> Lös 100 mg av rått-serumalbumin (RSA) i 6,667 ml 100 mM Natriumbikarbonat pH 9,0, slutlig koncentration 15 mg / ml i en 50 ml koniska rör. </li><li> Placera lösningen i is / vatten bägare och kyl till mellan 0 till 4 ° C. </li><li> Lägg 200 pl av hög kvalitet vattenfri dimetylformamid (DMF) till en 10 mg flaska av Texas Red sulfonylklorid (TRSC), virvel på medium i 15 sek. </li><li> Vortex RSA lösningen på medel...

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

Stegen markerade här representerar vad vi anser vara de som kommer att producera konsekventa och korrekta permeabilitetsvärden eftersom de kringgå följande fallgropar: <ol><li> Spridning: Användningen av en röd emitterande fluoroforerna möjliggöra mer effektiv uppsamling av ljus eftersom längre våglängd fotoner är mindre benägna att sprida. Använda antingen gröna eller blå avger fluoroforer kommer att införa större variation i generalsekretariatet på grund av ökad variabilitet i intensitet värde...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

Njursjukdomar där urinen stora viktiga makromolekyler, såsom serumalbumin, har länge ansetts vara orsakade av förändringar i permeabilitetsbarriären består av podocytes, vaskulära endotelceller, och ett basalmembran arbetar unisont. Data från vårt laboratorium använder intravital 2-foton mikroskopi visade en mer permeabel barriär glomerulär filtration (GFB) än vad man tidigare trott under fysiologiska förhållanden, med hämtning av filtrerat albumin förekommer i ett tidigt delmängd av celler som kallas proximala tubuli-celler (PTC) 1,2, tre. Tidigare tekniker som används för att studera njurfiltrationen och upprättande av karakteristiska för filtrering barriär som micropuncture av lumen av dessa tidiga rörformiga segment med provtagning av flytande innehåll och analys 4. Dessa studier bestäms albuminkoncentration i luminala vätskan att vara praktiskt taget obefintlig, motsvarande näramot vad som vanligtvis detekteras i urinen. Däremot avslöjade karakterisering av dextran polymerer med definierade storlekar från denna teknik de av en storlek som liknar serumalbumin hade högre nivåer i den rörformade lumen och urin, vilket tyder på ökad permeabilitet 5. Häri finns en detaljerad beskrivning av den teknik som används för att direkt visualisera och kvantifiera glomerulär fluorescerande albumin permeabilitet in vivo. Denna metod möjliggör detektion av filtrerat albumin över filtreringen barriären i Bowmans utrymme (den inledande avdelningen av urin filtrering), och tillåter också kvantifiering av albumin reabsorption av proximala tubuli och visualisering av efterföljande albumin transcytos 6. Frånvaron av fluorescerande albumin längs senare rörformiga segment väg till blåsan belyser effektiviteten hos hämtning banan i de äldre proximala tubuli segment. Dessutom, när denna teknik tillämpades bestämma permeabilitetav dextraner med en liknande storlek som albumin nästan identiska permeabilitetsvärden rapporterades 2. Dessa observationer stöder direkt behovet av att utöka fokus för många proteinuri njursjukdomar till inkluderade förändringar i proximala tubuli cell regenerering.

Figur 3 visar ett exempel på en bild tagen från en yta glomerulus av München Wistar Frömter råtta och de åtgärder som vidtagits för att bestämma permeabilitet fluorescerande albumin. GSC värde för albumin av 0,0111 härledas för denna person glomerulus faller inom samma område som hos denna stam av München Wistarråttor när i Fed skick 3. Stabiliteten ses i dessa bilder beror på noggrann planering och utförande av instruktioner som avbildas i figurerna 1 och 2.</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats at JoVE.com

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

En teknik som använder hög upplösning intavital 2-foton mikroskopi att direkt visualisera och kvantifiera gloemrular filtrering i ytan glomeruli. Denna metod möjliggör en direkt bestämning av permeabilitetsegenskaper makromolekyler i både normala och sjuka tillstånd.

Kvantifiering glomerulär permeabilitet av fluorescerande makromolekyler Använda 2-foton mikroskopi i München Wistarråttor

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Musmodell av typ 2-diabetes: Pancreatic Islet Isolering och Live-cell 2-Photon Imaging av intakt cellöar

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Intravital mikroskopi av tumör-associerad vaskulatur använder avancerade dorsala Skinfold fönster Chambers på transgena fluorescerande möss

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

En metod för att kvantifiera Upper Limb Performance i det dagliga livet som använder accelerometrar

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in MeniÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¨re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

In Vivo Morfometriska analys av mänskliga kranialnerver med magnetkamera i Menières sjukdom öron och Normal hörsel öron

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Bedömning av njurfunktion i musmodeller av glomerulär sjukdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal mätning av glomerulär filtrationshastighet hos möss

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Mycket känslig mätning av glomerulär permeabilitet hos möss med fluorescein isotiocyanat-polysackaros 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Helmonterad immunofluorescensfärgning, konfokal avbildning och 3D-rekonstruktion av den sinoatriella och atrioventrikulära noden i musen

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Isolering och kultur av bosatta hjärtmakrofager från murin sinoatriell och atrioventrikulär nod

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Analysera långsiktiga elektrokardiografiinspelningar för att upptäcka arytmier hos möss

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...