Name: quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells
Uploaded: 2013-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells at JoVE.com

أفادت الأبحاث في هذا المنشور كان مدعوما من المعهد الوطني للسرطان التابع لمعاهد الصحة القومية تحت رقم R01CA174385 جائزة. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

1. الكواشف إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد RPMI-PLGH عن طريق خلط 500 مل RPMI-1640 و 5 مل الستربتوميسين، كل من البنسلين، L-الجلوتامين، والحل HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد R10 حل عن طريق خلط RPMI-PLGH مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS). وFBS المعطل للحرارة بنسبة 56 ...

<ol>
	<li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma.">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients.">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8++T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis.">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li><li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies.">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8++T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li><li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+a+house+of+cards:+re-evaluating+CD8++T-cell+immune+correlates+against+HIV.">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li></ol>

وقد أوجزنا بروتوكول لفحص وحيدة الخلية الإنتاجية العالية عن طريق تمكين لحل الخلايا الحضانة المشتركة للالمستجيبات والأهداف في صفائف nanowells (الشكل 1). بالإضافة إلى الإنتاجية والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على رصد المستجيب بوساطة السمسة ضد الخلايا اله?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> RPMI-1640 ث / س الجلوتامين L- </td><td> Cellgro </td><td> 15-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td> 10،000 وحدة دولية البنسلين 10000 ميكروغرام / مل الستربتوميسين </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200 ملي مول الحل </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيغما الدريتش </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (FBS) </td><td> أتلانتا الحيوية </td><td> S11150 </td><td> الكثير اختبار </td></tr><tr><td> خلية المقتفي الأحمر وصمة عار </td><td> إينفيتروجن </td><td> C34552 </td><td> 50 ميكروغرام </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle البنفسج وصمة عار </td><td> إينفيتروجن </td><td> V35003 </td><td> 5 ملم </td></tr><tr><td> SYTOX الحمض النووي الخضراء وصمة عار </td><td> إينفيتروجن </td><td> S7020 </td><td> 5 ملم </td></tr><tr><td> Annexin V-اليكسا فلور 647 </td><td> إينفيتروجن </td><td> A23204 </td><td> 500 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Dulbecco في PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td> 500 مل </td></tr><tr><td> نبيلة أجار </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 غ </td></tr><tr><td> التريبان الأزرق </td><td> سيغما الدريتش </td><td> T8154 </td><td> 0،4٪ السائلة وتصفيتها العقيمة </td></tr><tr><td> عدادة الكريات </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> مشرق خط </td></tr><tr><td> 4-وحة جيدا </td><td> الحرارية فيشر </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick البلازما الأنظف </td><td> Harrick البلازما </td><td> PDC-32G </td><td> البلازما الأنظف الأساسية </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><tد&gt; </td><td> المجهر الفلورسنت (يعمل مع الأجزاء الثلاثة أدناه) </td></tr><tr><td> 10-3 لامدا </td><td> سوتر الصك </td><td></td><td> مرشح تحكم </td></tr><tr><td> امدا DG-4 </td><td> سوتر الصك </td><td></td><td> فائقة السرعة الطول الموجي الجلاد </td></tr><tr><td> هاماماتسو EM-CCD كاميرا </td><td> هاماماتسو </td><td> C9100-13 </td><td> مجهر الكاميرا CCD- </td></tr><tr><td> أنبوب مخروطي 15 مل </td><td> BD الصقر </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> أنبوب مخروطي 50 مل </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> نيكون Biostation </td><td> نيكون الآلات شركة </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> طبق زجاج أسفل الثقافة </td><td> شركة ماتيك </td><td> P35G-0 </td><td> طبق بتري 35 مم، 10 مم microwell </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

يمكن علاج مناعي السرطان تسخير خصوصية الاستجابة المناعية لاستهداف والقضاء على الأورام. وقد أظهرت بالتبني العلاج بالخلايا (ACT) استنادا إلى نقل بالتبني من الخلايا T المعدلة وراثيا للتعبير عن مستقبلات مستضد خيالية (CAR) وعد كبير في التجارب السريرية 1-4. هناك العديد من المزايا لاستخدام الخلايا T + CAR لعلاج السرطان بما في ذلك القدرة على استهداف مستضدات غير مقيد MHC والخلايا T functionalize من أجل البقاء الأمثل، واستمرار صاروخ موجه داخل المضيف، وأخيرا للحث على موت الخلايا المبرمج للCAR + T الخلايا في حالة سمية المضيف 5. ترسيم الوظائف الأمثل للخلايا T + CAR المرتبطة فائدة سريرية أمر ضروري لتصميم الجيل القادم من التجارب السريرية. التطورات الحديثة في مجال التصوير المجهري مثل الحيوانات الحية multiphoton أحدثت ثورة في دراسة وظيفة الخلايا المناعية طن فيفو 6،7. في حين أن هذه الدراسات تقدمت فهمنا للخلية T-ظائف في الجسم الحي، T-ACT خلية مقرها في التجارب السريرية يتطلب الحاجة إلى ربط الميزات الجزيئية والوظيفية للخلية T-الاستعدادات قبل التسريب مع الفعالية السريرية بعد التسريب، من خلال الاستفادة في المقايسات المختبر رصد الخلايا T-ظائف مثل إفراز خلوى السمسة و. وقد وضعت معيار التدفق الخلوي المقايسات تستند إلى تحديد الأداء العام للسكان من الخلايا T على مستوى وحيدة الخلية ولكن هذه ليست مناسبة لرصد وتشكيل المتقارن أعمار أو قدرة الخلية نفسها لقتل أهداف متعددة 8. صفائف Microfabricated مصممة في مثل البوليمرات حيويا polydimethylsiloxane (PDMS) هي وسيلة جذابة بشكل خاص لحصر مكانيا المستجيبات والأهداف في حجم صغير 9. بالاشتراك مع المجهري مضان الآلي الوقت الفاصل بين، ثويمكن رصدها من usands المستجيب المستهدفة التفاعلات في وقت واحد من الآبار الفردية تصوير مجموعة nanowell. نقدم هنا منهجية عالية الإنتاجية لرصد الخلايا T-السمسة بوساطة على مستوى وحيدة الخلية التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لدراسة وظائف الخلايا T لحل الخلايا.

ويتجلى مثال على تطبيق الفحص عالية الإنتاجية لحل الخلايا في الشكل 2. لفترة وجيزة، وصفت CD19 محددة CAR + T والخلايا شارك في المحتضنة مع خلايا فأر المسمى الهدف EL4 في الآبار الفردية للمجموعة nanowell (الأقسام 1-5). تم تسجيل صورة أولية عن المجهر الفلورسنت الآلي لتحديد ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells at JoVE.com

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

نحن وصف وحيدة الخلية الإنتاجية العالية فحص لقياس السمسة من الخلايا T عندما حضنت مع الخلايا المستهدفة الورم. هذا الأسلوب يستخدم مجموعة كثيفة من اللدائن المرنة، من شبه نانولتر الآبار (آبار ~ 100،000 / مجموعة) لحصر الخلايا T مكانيا والخلايا المستهدفة في نسب محددة ويقترن إلى مضان المجهر لمراقبة المستجيب المستهدفة الاقتران وموت الخلايا المبرمج اللاحقة.

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان<em&gt; في المختبر</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي، اختبار مزدوج قراءات من بين الخلايا مضادات الميكروبات آخر وحقيقية النواة السمية لخلايا

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

فحص فاعليه في الوقت الحقيقي للخلايا التائية لمستقبلات مستضد تشياريك التي تستهدف الخلايا السرطانية الصلبة والدموية

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

مقايسة الفائق تقييم وتقدير حجم تشكيل العَدلات فخ خارج الخلية

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...