Name: quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells
Uploaded: 2013-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells at JoVE.com

Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd gesteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award Aantal R01CA174385. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

1. Reagentia Voorbereiding <ol><li> Bereid RPMI-PLGH door mengen 500 ml RPMI-1640 en 5 ml elk van penicilline-streptomycine, L-glutamine en HEPES oplossing. </li><li> Bereid R10 oplossing mengen RPMI-PLGH met 10% foetaal runderserum (FBS). De FBS is hitte-geïnactiveerd bij 56 ° C gedurende 30 minuten voorafgaand aan toevoeging. </li><li> Voorverwarmen bij 37 ° C 50 ml van RPMI-PLGH, 15 ml PBS en 15 ml R10 in steriele conische buizen. </li><li> Fabricage van arrays van nanowells in PDMS: De silicium master vervaardi...

<ol>
	<li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma.">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients.">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8++T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis.">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li><li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies.">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8++T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li><li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+a+house+of+cards:+re-evaluating+CD8++T-cell+immune+correlates+against+HIV.">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li></ol>

We hebben geschetste protocol voor een high-throughput eencellige cytolytische assay geactiveerd door co-incubatie van effectors en doelen in arrays van nanowells (figuur 1). Naast throughput een belangrijk voordeel van de techniek is de mogelijkheid om effector-gemedieerde cytotoxiciteit tegen gewenste doelcellen volgen zonder doelcel techniek wat op zijn beurt het gebruik van autologe of matched / primaire tumorcellen als doelcellen. De ruimtelijke opsluiting maakt het ophalen en daaropvolgende kloner...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 15-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Cellgro </td><td> 30-002 CI- </td><td> 10.000 IU Penicilline 10.000 ug / ml streptomycine </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 CI- </td><td> 200 mM oplossing </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Lot getest </td></tr><tr><td> Cell Tracker Red Stain </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 ug </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle Violet Stain </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> SYTOX groene Nucleic Acid Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Annexine V-Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Noble agar </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> Trypan Blue </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T8154 </td><td> 0,4% vloeistof, steriel gefiltreerd </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> Heldere lijn </td></tr><tr><td> 4-putjesplaat </td><td> Thermo Fisher </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick Plasma Cleaner </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Basic plasma reiniger </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><td&gt; </td><td> Fluorescentie microscoop (werkt met de drie delen hieronder) </td></tr><tr><td> Lambda tien-drie </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Filter controller </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Ultra-High-Speed ​​Golflengte switcher </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD Camera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> CCD-Microscoop camera </td></tr><tr><td> 15 ml conische buis </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml conische buis </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Biostation </td><td> Nikon Instruments Inc </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> Met glazen bodem cultuur schotel </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G-0 </td><td> 35 mm petrischaaltje 10 mm microwell </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

Immunotherapie van kanker kunnen benutten van de specificiteit van immuunrespons op te richten en te elimineren tumoren. Adoptieve celtherapie (ACT) gebaseerd op de adoptieve overdracht van T-cellen genetisch gemodificeerd om een chimeer antigen receptor (CAR) expressie blijkt aanzienlijke belofte in klinische proeven 1-4. Er zijn verscheidene voordelen aan het gebruik CAR + T cellen voor de behandeling van kanker inclusief de mogelijkheid om niet-MHC beperkte antigenen te richten en de T-cellen voor optimale overleving, homing en persistentie in de gastheer functionaliseren en uiteindelijk apoptose induceren van CAR + T-cellen bij ontvangst toxiciteit 5. Afbakening van de optimale functies van CAR + T cellen geassocieerd met klinische voordelen zijn essentieel voor het ontwerpen van de volgende generatie klinische trials. Recente ontwikkelingen in levende dieren imaging zoals multifoton microscopie hebben een revolutie in de studie van de immuun cel functie in 6,7 vivo. Hoewel deze studies hebben ons begrip van T-cel functie in vivo, T-cel-gebaseerde ACT in klinische proeven vereist de noodzaak moleculaire en functionele kenmerken van T-cel preparaten koppelen pre-infusie met klinische werkzaamheid na de injectie door gebruik in vitro testen bewaken T-cel functies zoals, cytotoxiciteit en cytokine secretie. Flow-cytometrie standaard gebaseerde testen ontwikkeld die bepalen de algemene werking van populaties van T-cellen in de eencellige niveau, maar deze zijn niet geschikt voor het bewaken conjugaat vorming en levens of het vermogen van dezelfde cel te doden meerdere doelen 8. Microfabricated arrays ontworpen biocompatibele polymeren zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) een bijzonder aantrekkelijke methode om ruimtelijk beperken effectoren en targets in kleine volumes 9. In combinatie met automatische time-lapse fluorescentiemicroscopie, thousands van effector-target interacties gelijktijdig monitoren door beeldvorming afzonderlijke putjes van een nanowell array. We stellen hier een high-throughput methode daartoe T-cel gemedieerde cytotoxiciteit bij de eencellige niveau breed toepasbaar voor onderzoek naar de functies van cytolytische T-cellen.

Een voorbeeld van de toepassing van de high-throughput cytolytische assay aangetoond in figuur 2. Kort, gemerkt CD19-specifieke CAR + T-cellen werden geco-incubeerd met gelabelde muizen EL4 doelcellen in de afzonderlijke putjes van een nanowell array (hoofdstukken 1-5). Een eerste beeld werd opgenomen op de geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop om de bezettingsgraad (effectoren en / of doelstellingen) van elke nanowell te identificeren op de array (hoofdstuk 6). Beeldverwerking werd gebrui...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells at JoVE.com

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...