Name: quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells
Uploaded: 2013-02-02T14:00:00
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Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Câncer do Instituto Nacional de Saúde sob o número Prêmio R01CA174385. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde.

1. Preparação de reagentes <ol><li> Prepare RPMI-PLGH misturando 500 ml ml de RPMI-1640 e 5 de cada um de penicilina-estreptomicina, L-glutamina, HEPES e solução. </li><li> Prepare R10 solução misturando RPMI-PLGH com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS). O FBS inactivado pelo calor é a 56 ° C durante 30 min antes da adição. </li><li> Pré-aquecido a 37 ° C de 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, e 15 de R10 em tubos cónicos estéreis. </li><li> Fabricação de matrizes de nanowells em PDMS: O mestre de silício...

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	<li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma.">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients.">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8++T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis.">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li><li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies.">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8++T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li><li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+a+house+of+cards:+re-evaluating+CD8++T-cell+immune+correlates+against+HIV.">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li></ol>

Temos descrito o protocolo para um ensaio de elevado rendimento de célula única citolítica activado através de co-incubação de efectores e alvos em matrizes de nanowells (Figura 1). Além disso a taxa de transferência de uma grande vantagem da técnica é a capacidade de monitorizar efectora mediada por citotoxicidade contra células alvo desejadas, sem a necessidade para a engenharia de células alvo, que por sua vez permite o uso de autólogos ou matched / primário de células tumorais, como a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-glutamina </td><td> Cellgro </td><td> 15-040 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Cellgro </td><td> 30-002 CI- </td><td> 10.000 UI de penicilina estreptomicina 10000 ug / ml </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 CI- </td><td> 200 mM de solução de </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Lote testado </td></tr><tr><td> Rastreador de celular mancha vermelha </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 ug </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle Violeta Mancha </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> SYTOX Ácido Nucleico mancha verde </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Anexina V-Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 CV- </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Agar Noble </td><td> DISCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> Trypan Blue </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T8154 </td><td> 0,4% de líquido, filtrado estéril </td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> Linha brilhante </td></tr><tr><td> 4-bem chapa </td><td> Thermo Fisher </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick Cleaner Plasma </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Aspirador de plasma básica </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><td&gt; </td><td> Microscópio de fluorescência (funciona com as três partes abaixo) </td></tr><tr><td> Lambda 10-3 </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td><td> Filtro controlador </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td><td> Ultra-High-Speed ​​Wavelength switcher </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD da câmera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> Microscópio CCD da câmera </td></tr><tr><td> 15 tubo cônico ml </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubo cónico </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Biostation </td><td> Nikon Instruments Inc. </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> Vidro prato de cultura de fundo </td><td> MatTek Corporação </td><td> P35G-0 </td><td> 35 milímetros placa de Petri de 10 mm de micropoços </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

Imunoterapia do cancro pode aproveitar a especificidade da resposta imunitária para alvejar e eliminar tumores. Terapia celular adoptiva (ACT) com base na transferência adoptiva de células T geneticamente modificadas para expressar um receptor de antigénio quimérico (CAR) se mostrou promissora em ensaios clínicos 1-4. Existem várias vantagens de usar CAR + células T para o tratamento de cancros, incluindo a capacidade para alvejar os antigénios do MHC não-limitados e para funcionalizar as células T para a sobrevivência óptima, homing e persistência no interior do hospedeiro, e, finalmente, para induzir a apoptose de CAR + As células T, em caso de toxicidade central 5. Delineando as funções ideais de CAR + células T associados com o benefício clínico é essencial para projetar a próxima geração de ensaios clínicos. Os recentes avanços na imagem animal vivo como microscopia multifotônica revolucionaram o estudo da função de células imunes in vivo 6,7. Embora estes estudos tenham avançado a nossa compreensão da função das células T in vivo, de células T ACT baseada em ensaios clínicos exige a necessidade de ligar as características moleculares e funcionais de células T preparações pré-infusão com eficácia clínica pós-perfusão, utilizando-se, em Os ensaios in vitro de células T de monitorização funções como, citotoxicidade e a secreção de citocinas. Padrão de citometria de fluxo-ensaios baseados foram desenvolvidos para determinar o funcionamento geral das populações de células T ao nível de uma única célula, mas estes não são adequados para a monitorização e a formação de conjugado vidas ou a capacidade da mesma célula para matar alvos múltiplos 8. Matrizes microfabricated projetados em polímeros biocompatíveis como polidimetilsiloxano (PDMS) é um método particularmente atraente para confinar espacialmente efetores e metas em pequenos volumes 9. Em combinação com a microscopia de fluorescência automatizado lapso de tempo, thousands de-alvo efetor interações podem ser monitoradas simultaneamente por poços individuais de imagem de uma matriz nanowell. Apresentamos aqui um método de alto rendimento para a monitorização de células T da citotoxicidade mediada ao nível de uma única célula que pode ser amplamente aplicado para estudar a função de células T citolíticas.

Um exemplo da aplicação do ensaio de elevado débito citolítica é demonstrado na Figura 2. Resumidamente, CD19 marcado específico CAR + células T foram co-incubadas com células EL4 marcadas rato alvo nos poços individuais de uma matriz nanowell (secções 1-5). Uma imagem inicial foi gravado no microscópio fluorescente automatizada para identificar a ocupação (efectores e / ou alvos) de cada nanowell único na matriz (Secção 6). Processamento de imagem foi usada para identificar ...

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Descrevemos uma única célula ensaio de elevado débito para medir a citotoxicidade de células T, quando incubado com as células-alvo tumorais. Este método emprega uma matriz elastomérica denso, de sub-nanolitro poços (~ 100000 poços matriz /) para confinar espacialmente as células T e as células alvo em proporções definidas e está acoplado a microscopia de fluorescência para monitorizar alvo efetuador conjugação e apoptose subsequente.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Imunologia e Infecção

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Uma avaliação quantitativa da migração celular pelo ensaio Phagokinetic faixa Motilidade

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...