Name: quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells
Uploaded: 2013-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells at JoVE.com

Forskningen redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute i National Institutes of Health i Award nummer R01CA174385. Innehållet är endast ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.

1. Reagens Förberedelser <ol><li> Framställ RPMI-PLGH genom blandning 500 ml RPMI-1640 och 5 ml vardera av penicillin-streptomycin, L-glutamin, och HEPES-lösning. </li><li> Bered R10 lösning genom att blanda RPMI-PLGH med 10% fetalt bovint serum (FBS). FBS är värmeinaktiveras vid 56 ° C under 30 min före tillsats. </li><li> Pre-varm vid 37 ° C 50 ml RPMI-PLGH, 15 PBS ml och 15 ml R10 i sterila koniska rör. </li><li> Tillverkning av grupper av nanowells i PDMS: Kisel Master är tillverkad med fotolitografi v?...

<ol>
	<li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma.">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients.">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8++T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis.">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li><li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies.">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8++T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li><li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+a+house+of+cards:+re-evaluating+CD8++T-cell+immune+correlates+against+HIV.">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li></ol>

Vi har beskrivit protokollet för en hög genomströmning encelliga cytolytisk analys aktiveras via samtidig inkubation av effektorer och mål i grupper av nanowells (Figur 1). Förutom genomströmning en stor fördel med tekniken är möjligheten att övervaka effektor-medierad cytotoxicitet mot önskade målceller utan behov av målcellen teknik som i sin tur möjliggör användning av autologa eller matchade / primär tumörceller som målceller. Den rumsliga inneslutning tillåter hämtning och efte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / material </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-glutamin </td><td> Cellgro </td><td> 15-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-streptomycin </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-Cl </td><td> 10.000 IE Penicillin 10.000 pg / ml streptomycin </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-Cl </td><td> 200 mM lösning </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Lot testade </td></tr><tr><td> Cell Tracker röd fläck </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 pg </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle Violet Stain </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> SYTOX grön nukleinsyra Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Annexin V-Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 pl </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Ädelagar </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> Trypanblått </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T8154 </td><td> 0,4% vätska, sterilfiltrerades </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> Bright linje </td></tr><tr><td> 4-brunnsplatta </td><td> Thermo Fisher </td><td> 167.603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick Plasma Cleaner </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Grundläggande plasma renare </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><td&gt; </td><td> Fluorescensmikroskop (fungerar med de tre delarna nedan) </td></tr><tr><td> Lambda 10-3 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Filterregulator </td></tr><tr><td> Lambda GD-4 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Ultra-High-Speed ​​Våglängd omkopplare </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD-kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> CCD-kamera Microscope </td></tr><tr><td> 15 ml koniskt rör </td><td> BD Falcon </td><td> 352.097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml koniskt rör </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Biostation </td><td> Nikon Instruments Inc. </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> Glas botten odlingsskål </td><td> Mattek Corporation </td><td> P35G-0 </td><td> 35 mm petriskål, 10 mm mikrobrunn </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

Cancer immunterapi kan utnyttja specificitet immunsvaret att rikta och eliminera tumörer. Adoptiv cellterapi (ACT) baserat på adoptiv överföring av T-celler genetiskt modifierade för att uttrycka en chimär antigenreceptor (CAR) har visat mycket lovande i kliniska prövningar 1-4. Det finns flera fördelar med att använda CAR + T-celler för behandling av cancer, inklusive förmågan att rikta icke-MHC begränsade antigener och att funktionalisera de T-celler för optimal överlevnad, målsökande och uthållighet i värden, och slutligen för att inducera apoptos av CAR + T-celler i händelse av värdtoxicitet 5. Avgränsar de optimala funktioner CAR + T-celler associerade med klinisk nytta är avgörande för utformningen av nästa generation av kliniska prövningar. Senaste framstegen inom levande djur avbildning som multiphoton mikroskopi har revolutionerat studiet av immunceller funktion iN in vivo 6,7. Även om dessa studier har avancerat vår förståelse av T-cellfunktioner in vivo, T-cell baserad ACT i kliniska prövningar kräver att behovet av att koppla molekylära och funktionella egenskaper hos T-cell preparat före infusion med klinisk effekt efter infusionen, genom att utnyttja i vitro-analyser övervakning T-cellfunktioner som, cytotoxicitet och cytokin sekretion. Standard flödescytometri baserade analyser har utvecklats som bestämmer den övergripande funktion av populationer av T-celler vid encelliga nivå men dessa är inte lämpliga för övervakning av konjugat-bildning och livslängd eller förmågan hos samma cell för att döda flera mål 8. Mikrofabricerade matriser utformade i biokompatibla polymerer som polydimetylsiloxan (PDMS) är en särskilt attraktiv metod för att rumsligt begränsa effektorer och mål i små volymer 9. I kombination med automatiserad time-lapse fluorescensmikroskopi, thousands av effektor-mål interaktioner kan övervakas samtidigt av avbildning enskilda brunnar i en nanowell array. Vi presenterar här en hög genomströmning metod för övervakning av T-celler förmedlad cytotoxicitet vid encelliga nivå som kan tillämpas i stor utsträckning för att studera den cytolytiska funktionaliteten av T-celler.

Ett exempel på tillämpningen av hög genomströmning cytolytiska analysen visas i figur 2. Kortfattat, märkt CD19-specifika CAR + T-celler sam-inkuberas med märkt mus EL4 målceller i de enskilda brunnarna i en nanowell array (avsnitt 1-5). En första bild spelades in på automatiserade fluorescerande mikroskop för att identifiera beläggning (effektorer och / eller mål) för varje enskild nanowell på matrisen (avsnitt 6). Bildbehandling användes för att identifiera alla nanowells in...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells at JoVE.com

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Vi beskriver en encellig hög genomströmning analys för att mäta cytotoxicitet hos T-celler när de inkuberas med tumörmålceller. Denna metod använder en tät, elastomer matris av sub-nanoliter brunnar (~ 100.000 brunnar / grupp) att rumsligt begränsa de T-celler och målceller vid definierade förhållanden och är kopplad till fluorescensmikroskopi för att övervaka effektor-mål konjugering och efterföljande apoptos.

Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

En kvantitativ utvärdering av cellmigration genom Phagokinetic Track Motility analys

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analys för kvantifiering av intracellulär mykobakteri anpassad för screening med högt genomströmning/högt innehåll

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hög-throughput kvantitativ realtids-RT-PCR-analys för bestämning av uttryck Profiler av typ I och III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hög genomströmning Mätning av extracellulärt DNA utsläpp och Kvantitativ NET bildning i humana neutrofiler<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Hög genomströmning, i realtid, med dubbla avläsning Provning av intracellulära antimikrobiell aktivitet och eukaryot cell cytotoxicitet

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En fluorescensbaserade lymfocyter analys Lämplig för high-throughput screening av små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Hög genomströmning mätning av plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

En potens-analys i real tid för chimeric antigen receptor T-celler riktade mot solida och hematologiska cancer celler

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

En hög genomströmning analysen att bedöma och kvantifiera neutrofila extracellulära fälla bildandet

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...