Name: genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

De auteurs willen graag Dr Deirdre Nelson bedanken voor nuttige opmerkingen en voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie ​​DE019244, DE019197 en DE021841 te ML, F32DE02098001 aan SJS en C06 RR015464 aan de Universiteit van Albany, SUNY.

Het protocol bestaat uit vier stappen, zoals afgebeeld in figuur 1. Alle stappen worden beschreven in detail. Adenovirus constructie en virale zuivering te worden uitgevoerd vóór de orgaanroof voor gebruik in de genetische transductie van epitheliale rudiments ontleed. Alle standaard BSL-2 veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het werken met adenovirussen. 1. Muis embryonale Submandibulaire Gland (SMG) Oogst en Microdissection <ol><li> Euthanaseren timed-zwang...

<ol>
	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland.">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li><li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development:+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms.">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li><li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis:+investigating+growth+factor/matrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development.">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li><li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+collagen.">The chemistry and biology of collagen.</a> The Proteins. 4, 412-632 (1979).</li><li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin,+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture.">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity.">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li><li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis.">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li><li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

De ex vivo epitheliale-mesenchymale recombinatie techniek werd voor het eerst gepubliceerd voor submandibulaire speekselklieren in 1981 16. In dit protocol, we breiden de oorspronkelijke methode, met behulp van adenovirale infectie aan epitheliale cellen genexpressie te manipuleren in het kader van een gerecombineerde klier. Aangetoond dat het percentage van de epitheliale cellen geïnfecteerd met het adenovirus, dat het percentage cellen die zijn geïnfecteerd afhankelijk van de eigenschappen van de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12-medium zonder fenolrood </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline en streptomycine </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> 10X voorraad </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Bevriezen eenmalig gebruik monsters bij-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fractie V, lage endotoxine </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8,138-1 </td><td> Moet een hoge titer (1x10 10 pfu / ml) zijn. CsCl gezuiverde virussen effectiever zijn dan een kolom gezuiverd virus in deze assay. </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td&gt; Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Verdund tot 2% in PBS met 5% sucrose (w / v) </td></tr><tr><td> 1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Bereid uit 10X voorraad </td></tr><tr><td> Balanced Salt Hank&#39;s oplossing </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> no Calcium, geen magnesium, geen fenolrood </td></tr><tr><td> Transferrine </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml voorraadoplossing in DMEM/F12 media. Bevriezen eenmalig gebruik monsters bij-20C </td></tr><tr><td> L-ascorbinezuur (vitamine C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml voorraadoplossing in DMEM/F12 media.Freeze eenmalig gebruik monsters bij-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. Lijst van reagentia die voor SMG recombinatie protocol. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm steriel plastic schaaltjes </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Niet weefselkweek behandelde platen kunnen ook worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Stereo ontleden microscoop met doorvallend licht-basis </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Eventuele stereo-dissectiemicroscoop kan worden gebruikt dat is voorzien van een doorvallend licht-basis. </td></tr><tr><td> 35 mm weefselkweekplaten </td><td> Valk </td><td> 353001 </td><td> Niet weefselkweek behandelde platen kunnen ook worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Diameter van 50 mm microwell gerechten </td><td> MatTek Corporation </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch membraanfilters </td><td> Whatman papier </td><td> 110405 </td><td> 13 mm diameter, 0,1 mm poriegrootte </td></tr><tr><td> Widefield fluorescentiemicroscoop </td><td> Carl Zeiss, USA </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Elke fluorescentie microscoop (rechtop, inverted of stereo dissectiemicroscoop) kan worden gebruikt om GFP expressie controleren bij een lage vergroting met een aangesloten digitale camera. </td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Confocale microscopie is nodig om gedetailleerde celstructuren te zien. Elke confocale microscoop kunnen worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Timed-zwangere vrouwelijke muizen, stam CD-1 of ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Embryo&#39;s geoogst op dag 13 (dag met plug ontdekking aangeduid als dag 0). </td></tr><tr><td> Scalpel # 11 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpelhouder # 3 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 tang inox-legering, 0.05mm X 0.02mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-20 </td><td> Ideaal voor het oogsten van klieren uit embryo&#39;s </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 pincet dumostar legering, 0.05mm X 0.01mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.295-20 </td><td> Fine tips zijn nodig voor het verwijderen van epitheel mesenchym. Tungsten naalden kunnen ook worden gebruikt. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 2. Apparatuur gebruikt in de SMG recombinatie protocol. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Vertakkende morfogenese optreedt tijdens de ontwikkeling van vele organen en de muis embryonale submandibulaire klier (SMG) is een klassieke model voor de studie van vertakking morfogenese. In ontwikkelingslanden SMG impliceert dit proces iteratieve stappen van epitheliale knop en kanaal vorming uiteindelijk leiden tot een complex netwerk van vertakte acini en leidingen, die dienen te produceren wijzigen en / transporteren speeksel, respectievelijk in de mondholte 1 - 3. De epitheel-geassocieerde basaalmembraan en aspecten van de mesenchymale compartiment zoals de mesenchymcellen, groeifactoren en extracellulaire matrix, geproduceerd door deze cellen zijn essentieel voor de vertakking mechanisme, hoewel hoe de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen worden gecoördineerd echter niet goed begrepen 4 . De studie van de moleculaire mechanismen die epitheliale morfogenese ons begrip van ontwikkelingsmechanismen en geeft inzicht in mogelijke geregenereerdtieve geneeskunde benaderingen. Deze studies door het ontbreken van effectieve methoden voor genetische manipulatie van de speekselklieren epitheel belemmerd. Momenteel adenovirale transductie de meest effectieve methode voor het richten epitheelcellen in volwassen klieren in vivo 5. Echter in embryonale explantaten, dichte mesenchym en de kelder membraan rond de epitheelcellen belemmert virale toegang tot de epitheelcellen. Als het mesenchym wordt verwijderd, kan het epitheel worden getransfecteerd met adenovirussen en epitheliale beginselen kunnen hervatten vertakking morfogenese in aanwezigheid van Matrigel of laminine-111 6,7. Mesenchym-vrij epitheliale rudiment groei vereist ook extra suppletie met oplosbare groeifactoren en niet volledig herhalen vertakking morfogenese als het zich voordoet in intacte klieren 8. Hier beschrijven we een techniek die adenovirale transductie van epitheelcellen en cultuur van de getransfecteerde e vergemakkelijktpithelium met bijbehorende mesenchym. Na microdissectie van de embryonale SMG, verwijdering van het mesenchym en virale infectie van het epitheel met een GFP-bevattende adenovirus, aangetoond dat het epitheel spontaan recombineert met ongeïnfecteerde mesenchym met vermelding intact SMG glandulaire structuur en vertakking morfogenese. De genetisch gemodificeerde epitheliale celpopulatie kan eenvoudig worden gecontroleerd met standaard fluorescentiemicroscopiemethodes als fluorescent-gemerkte adenovirale constructen gebruikt. Het weefsel recombinatie hier beschreven methode is momenteel de meest efficiënte en toegankelijke methode voor transfectie van epitheelcellen met een wild-type of mutant vector in een complex 3D weefsel construct dat niet nodig genereren van transgene dieren.

De stroom van de belangrijkste experimentele stappen wordt geschetst in figuur 1. Een voorbeeld van een intact SMG, een geïsoleerde epitheliale rudiment en de bijbehorende mesenchym zijn weergegeven in figuur 2. Helderveld beelden van gerecombineerde SMG, die nog steeds ondergaan vertakkende morfogenese indien gekweekt ex vivo gedurende de aangegeven tijden, worden getoond in Figuur 3. Gerecombineerde klieren gekweekt gedurende 48 uur tot expressie epitheliale...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Een techniek om genetisch te manipuleren epitheelcellen binnen het gehele<em&gt; Ex vivo</em&gt; Gekweekte embryonale muis submandibulaire klieren (SMG) met behulp van virale gen-overdracht wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van het aangeboren vermogen van SMG epitheel en mesenchym spontaan recombineren na scheiding en infectie van epitheliale rudiments met adenovirale vectoren.

Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Ontleding van Midgut en speekselklieren van de Ae. aegypti Muggen

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS Device Fabrication en modificatie van het oppervlak

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Bereiding van 2-dGuo behandelde Thymus Organ culturen

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolatie van Mouse speekselklier Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

DNA-methylatie: bisulfiet Wijziging en Analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Bereiding van de Mgm101 recombinatie eiwit met MBP-based Tagging strategie

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...