Name: genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei Dr. Deirdre Nelson für hilfreiche Kommentare und für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse DE019244, DE019197 und DE021841 um ML, F32DE02098001 um SJS und C06 RR015464 der University at Albany, SUNY finanziert.

Das Protokoll enthält vier wesentliche Schritte, wie in Abbildung 1 dargestellt. Alle Schritte werden ausführlich beschrieben. Adenovirus Konstruktion und viralen Reinigung sollte vor der Organraub zur Verwendung in der genetischen Transduktion seziert epithelialen Rudimente durchgeführt werden. Alle Standard-BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen sollten bei der Arbeit mit Adenoviren werden. Ein. Maus Embryonale submandibularis (SMG) Ernte und Mikrodissektion <ol><li> Einschläfern...

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	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland.">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li><li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development:+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms.">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li><li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis:+investigating+growth+factor/matrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development.">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li><li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+collagen.">The chemistry and biology of collagen.</a> The Proteins. 4, 412-632 (1979).</li><li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin,+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture.">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity.">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li><li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis.">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li><li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

Die ex vivo epitheliale-mesenchymale Rekombination Technik wurde erstmals für submandibular Speicheldrüsen im Jahr 1981 16 veröffentlicht. Bei diesem Protokoll, wir auf die ursprüngliche Methode erweitern, unter Verwendung adenoviraler Infektion Epithelzelle Genexpression im Kontext eines rekombinierten Drüse manipulieren. Wir zeigen, dass ein Prozentsatz der Epithelzellen mit dem Adenovirus infiziert sind, während der Prozentsatz an Zellen, die infiziert sind, hängt von den Eigenschaften des ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 Medium ohne Phenolrot </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin und Streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> 10X Lager </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Frieren Sie den einmaligen Gebrauch Aliquots bei-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fraction V, niedrige Endotoxin </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Sollte hohe Titer (1x10 10 pfu / ml) betragen. CsCl gereinigten Viren sind wirksamer als säulengereinigt Viren in diesem Assay. </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td&gt; Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Verdünnt auf 2% in PBS mit 5% Sucrose (w / v) </td></tr><tr><td> 1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Hergestellt aus 10X Lager </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenol Red </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml Stammlösung in DMEM/F12 Medien. Frieren Einweg-Aliquots bei-20C </td></tr><tr><td> L-Ascorbinsäure (Vitamin C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml Stammlösung in DMEM/F12 media.Freeze Einweg-Aliquots bei-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Liste der Reagenzien für SMG Rekombination Protokoll erforderlich. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm sterile Plastikschalen </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Nicht-Gewebekultur-behandelten Platten können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td> Stereo Binokular mit Durchlichtbasis </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Jede Stereo Präpariermikroskop können verwendet, das eine Durchlichtbasis werden. </td></tr><tr><td> 35 mm-Gewebekulturschalen </td><td> Falke </td><td> 353001 </td><td> Nicht-Gewebekultur-behandelten Platten können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td> 50 mm Durchmesser Mikrowell Gerichten </td><td> MatTek Konzern </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch Membranfilter </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> 13 mm Durchmesser, 0,1 mm Porengröße </td></tr><tr><td> Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop </td><td> Carl Zeiss, USA </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Jede Fluoreszenzmikroskop (aufrecht, inverted oder Stereo Präpariermikroskop) kann zum GFP-Expression bei geringer Vergrößerung überwachen mit angeschlossenem digitalen Kamera werden. </td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Konfokale Mikroskopie ist notwendig, um detaillierte Zellstrukturen zu sehen. Jede Konfokalmikroskop können verwendet werden. </td></tr><tr><td> Timed-schwangeren weiblichen Mäusen, Stamm CD-1-oder ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Embryonen werden am Tag 13 (mit Tag der Plug Entdeckung als Tag 0 bezeichnet) geerntet. </td></tr><tr><td> Skalpellklingen Nr. 11 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Skalpellgriff # 3 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zangen inox-Legierung, 0,05 X 0,02 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-20 </td><td> Ideal für die Ernte Drüsen aus Embryonen </td></tr><tr><td&gt; Dumont Nr. 5 Zangen dumostar Legierung, 0,05 X 0,01 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295-20 </td><td> Feine Spitzen zum Entfernen von Mesenchym aus Epithel erforderlich. Wolframnadeln können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 2. Ausrüstung in SMG Rekombination Protokoll verwendet. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Branching Morphogenese tritt während der Entwicklung vieler Organe und die embryonale Maus submandibularis (SMG) ist ein klassisches Modell für die Untersuchung der Verzweigung Morphogenese. In der sich entwickelnden SMG beinhaltet dieses Verfahren iterativen Schritten von epithelialen Knospe und Kanal Formation, um letztendlich Anlass zu einem komplexen verzweigtes Netzwerk von Acini und Leitungen, die zu erzeugen und zu modifizieren / transportieren den Speichel bzw. in die Mundhöhle 1 dienen - 3. Das Epithel-assoziierten Basalmembran und Aspekte der mesenchymalen Abteil, einschließlich der Mesenchymzellen, Wachstumsfaktoren und der extrazellulären Matrix, die von diesen Zellen produziert werden, sind für die Verzweigungsmechanismus, obwohl, wie die zellulären und molekularen Ereignisse koordiniert bleibt kaum verstanden 4 . Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die epithelialen Morphogenese unser Verständnis von Entwicklungsstörungen Mechanismen und bietet einen Einblick in mögliche Regenerationtive Medizin Ansätze. Solche Studien wurden aufgrund des Mangels an effektiven Methoden zur genetischen Manipulation der Speicheldrüse Epithel behindert. Derzeit stellt adenovirale Transduktion die effektivste Methode für die Ausrichtung Epithelzellen in der Erwachsenenbildung Drüsen in vivo 5. Doch in embryonalen Explantate behindert dichten Mesenchym und die Basalmembran umgibt die Epithelzellen viralen Zugang zu den Epithelzellen. Wenn die Mesenchym entfernt wird, kann das Epithel transfiziert mit Adenoviren werden, und wieder aufgenommen werden kann epithelialen Rudimente Verzweigungsmittel Morphogenese in Gegenwart von Matrigel oder Laminin-111 6,7. Mesenchym-free epithelialen Rudiment Wachstum erfordert auch zusätzliche Nahrungsergänzung mit löslichen Wachstumsfaktoren und nicht vollständig rekapitulieren Verzweigung Morphogenese, wie es in intakten Drüsen 8 auftritt. Hier beschreiben wir eine Technik, die adenovirale Transduktion von Epithelzellen und Kultur der transfizierten e erleichtertpithelium mit zugehörigen Mesenchym. Nach Mikrodissektion der embryonalen Maschinenpistolen, Entfernung des Mesenchym und Virusinfektion des Epithels mit einem GFP-haltigen Adenovirus zeigen wir, dass das Epithel sich spontan rekombiniert mit nichtinfizierten Mesenchym rekapituliert intakten SMG glandulären Strukturen und Verzweigungsmittel Morphogenese. Die gentechnisch veränderten epithelialen Zell-Population kann leicht überwacht werden unter Verwendung von Standard Fluoreszenzmikroskopie Methoden, wenn Fluoreszenz-markierten adenovirale Konstrukte verwendet werden. Das Gewebe Rekombination hier beschriebene Verfahren ist derzeit das wirksamste und zugänglich Verfahren zur Transfektion von epithelialen Zellen mit einem Wildtyp-oder mutierten Vektor innerhalb eines komplexen 3D Gewebekonstrukt, das keine Erzeugung transgener Tiere.

Die Strömung der großen experimentellen Schritte ist in 1 skizziert. Ein Beispiel eines intakten SMG, einem isolierten Epithelzellen Rudiment, und seine entsprechende Mesenchym sind in Abbildung 2 gezeigt. Hellfeld Bilder von rekombinierten Maschinenpistolen, die zu unterziehen Verzweigungsmittel Morphogenese bei kultivierten ex vivo für die angegebenen Zeiten, in Abbildung 3 dargestellt fort. Rekombinierte Drüsen für 48 hr exprimieren epi...

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Eine Technik, genetisch zu manipulieren Epithelzellen innerhalb der gesamten<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierten embryonalen Maus submandibularis (SMGs) mit viralen Gentransfer beschrieben. Diese Methode nutzt die angeborene Fähigkeit der SMG Epithel und Mesenchym spontan nach der Trennung und Infektion von Epithelzellen Rudimente mit adenoviralen Vektoren rekombinieren.

Genetic Modification und Rekombination von Speicheldrüsen Organkulturen

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