Name: genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Deirdre Nelson per gli utili commenti e per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH DE019244, DE019197 e DE021841 a ML, F32DE02098001 di SJS e C06 RR015464 all&#39;Università di Albany, SUNY.

Il protocollo prevede quattro fasi principali, come illustrato nella Figura 1. Tutti i passaggi sono descritti in dettaglio. Costruzione adenovirus e purificazione virale deve essere fatto prima della raccolta di organi per l&#39;uso nella trasduzione genetica di sezionati rudimenti epiteliali. Tutti gli standard di BSL-2 misure di sicurezza devono essere seguite quando si lavora con adenovirus. 1. Embrionali di topo sottomandibolare Gland (SMG) Raccolta e Microdissection ...

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	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. 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L&#39;ex vivo epitelio-mesenchimale tecnica di ricombinazione è stato pubblicato per la sottomandibolare ghiandole salivari nel 1981 16. In questo protocollo, si ampliano il metodo originale, usando l&#39;infezione adenovirale per manipolare cellule epiteliali espressione genica nel contesto di una ghiandola ricombinato. Abbiamo dimostrato che una percentuale delle cellule epiteliali sono infettati con l&#39;adenovirus, mentre la percentuale di cellule che sono infettate dipende dalle proprietà del...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 americano senza rosso fenolo </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina e streptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> Magazzino 10X </td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Congelare aliquote monouso a-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Frazione V, endotossine basso </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Dovrebbe essere alto titolo (1x10 10 pfu / ml). CsCl virus purificate sono più efficaci di virus purificato su colonna in questo saggio. </td></tr><tr><td> 16% paraformaldeide </td><td&gt; Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td><td> Diluita al 2% in PBS con 5% di saccarosio (w / v) </td></tr><tr><td> 1X tampone fosfato salino (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Preparato da stock 10X </td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> no Calcio, Magnesio no, no rosso fenolo </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml di soluzione in magazzino DMEM/F12 media. Congelare monouso aliquote a-20C </td></tr><tr><td> Acido L-ascorbico (vitamina C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml di soluzione concentrata in DMEM/F12 media.Freeze monouso aliquote a-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Elenco dei reagenti necessari per SMG protocollo ricombinazione. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 piatti centimetri plastica sterili </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Piastre di coltura di tessuti-non-trattata può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Stereo microscopio da dissezione con base a luce trasmessa </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Ogni dissezione stereo microscopio può essere utilizzato che ha una base a luce trasmessa. </td></tr><tr><td> 35 millimetri di tessuto di coltura piatti </td><td> Falco </td><td> 353001 </td><td> Piastre di coltura di tessuti-non-trattata può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Diametro 50 mm micropozzetti piatti </td><td> MatTek Corporation </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch filtri a membrana </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> Diametro di 13 mm, 0,1 millimetri dimensione dei pori </td></tr><tr><td> Widefield microscopio a fluorescenza </td><td> Carl Zeiss, Stati Uniti d&#39;America </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Ogni microscopio a fluorescenza (in posizione verticale, inverted o stereo microscopio da dissezione) può essere utilizzato per monitorare l&#39;espressione della GFP a basso ingrandimento con una fotocamera digitale allegata. </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Microscopia confocale è necessario vedere le strutture cellulari dettagliate. Qualsiasi microscopio confocale può essere utilizzato. </td></tr><tr><td> Topi di sesso femminile in stato di gravidanza, a tempo-deformazione CD-1 o ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Gli embrioni sono raccolti il ​​giorno 13 (con il giorno della scoperta spina designato come giorno 0). </td></tr><tr><td> Bisturi # 11 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Manico bisturi # 3 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinze in lega di acciaio inox, 0,05 millimetri 0,02 millimetri X </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11252-20 </td><td> Ideale per la raccolta di ghiandole da embrioni </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 forcipe dumostar lega, 0,05 millimetri 0,01 millimetri X </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11295-20 </td><td> Punta fine sono necessari per la rimozione di mesenchima da epitelio. Aghi tungsteno può anche essere usato. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Apparecchiatura utilizzata nelle SMG protocollo di ricombinazione. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Branching morfogenesi avviene durante lo sviluppo di molti organi, e l&#39;embrione ghiandola sottomandibolare mouse (SMG) è un modello classico per lo studio di branching morfogenesi. Nel SMG sviluppo, questo processo comporta fasi iterative di gemma epiteliale e formazione condotto, per dare infine origine a una complessa rete ramificata di acini e condotti, che servono per produrre e modificare / trasportare la saliva, rispettivamente, nella cavità orale 1 - 3. Il epiteliale associata membrana basale e aspetti del compartimento mesenchimale, comprese le cellule mesenchimali, fattori di crescita e la matrice extracellulare, prodotti da queste cellule, sono fondamentali per il meccanismo di ramificazione, anche se come gli eventi cellulari e molecolari sono coordinate rimane poco compresa 4 . Lo studio dei meccanismi molecolari di guida anticipi morfogenesi epiteliali la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e permette di comprendere meglio possibile rigeapprocci di medicina ative. Tali studi sono stati ostacolati a causa della mancanza di metodi efficaci per la manipolazione genetica dell&#39;epitelio salivare. Attualmente, trasduzione adenovirale rappresenta il metodo più efficace per il targeting cellule epiteliali in ghiandole adulti in vivo 5. Tuttavia, in espianti embrionali, mesenchima denso e la membrana basale che circonda le cellule epiteliali ostacolo all&#39;accesso virale alle cellule epiteliali. Se il mesenchima viene rimosso, l&#39;epitelio possono essere trasfettate con adenovirus, e può riprendere rudimenti epiteliali branching morfogenesi in presenza di Matrigel o laminina-111 6,7. Mesenchima-free crescita epiteliale rudimento richiede anche una ulteriore integrazione con fattori di crescita solubili e non pienamente ricapitolare morfogenesi ramificazione come si verifica in ghiandole intatti 8. Qui si descrive una tecnica che facilita adenovirale trasduzione delle cellule epiteliali e la cultura del e transfettatepithelium con mesenchima associati. Dopo microdissezione dei fucili mitragliatori embrionali, la rimozione del mesenchima, e l&#39;infezione virale dell&#39;epitelio con una GFP contenente adenovirus, si dimostra che l&#39;epitelio ricombina spontaneamente con mesenchima non infetti, ricapitolando intatta la struttura ghiandolare SMG e la ramificazione morfogenesi. La popolazione geneticamente modificato delle cellule epiteliali possono essere facilmente monitorato con metodi standard di microscopia a fluorescenza, fluorescenza se-tagged costrutti adenovirali sono utilizzati. Il metodo di ricombinazione tessuto descritto è attualmente il metodo più efficace ed accessibile per la trasfezione di cellule epiteliali con un vettore wild-type o mutanti all&#39;interno di un costrutto complesso tessuto 3D che non richiede la generazione di animali transgenici.

Il flusso delle fasi principali sperimentali è descritto nella Figura 1. Un esempio di un SMG intatto, un rudimento isolato epiteliale, e il mesenchima corrispondenti sono mostrati nella Figura 2. Immagini brightfield di SMGs ricombinati, che continuano a subire branching morfogenesi quando coltivate ex vivo per i tempi riportati, sono mostrati in Figura 3. Ghiandole ricombinati coltivate per 48 ore esprimere GFP epiteliale sono mostrati in Figura 4.</...

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in tutta<em&gt; Ex vivo</em&gt; Embrionali di topo in coltura ghiandole sottomandibolari (SMG) con il trasferimento del gene virale è descritto. Questo metodo sfrutta la capacità innata di SMG epitelio e mesenchima di ricombinare spontaneamente dopo la separazione e l&#39;infezione dei rudimenti epiteliali con vettori adenovirali.

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