Name: genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00
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著者らは、有益なコメントや原稿の批判的な読みのための博士ディアドラネルソンに感謝したいと思います。この作品は、アルバニー大学、ニューヨーク州立大学にNIHの助成DE019244、DE019197、DE021841とML​​に、F32DE02098001 SJSへ、そしてC06 RR015464によって賄われていた。

プロトコルは、 図1に示した4つの主要な手順が含まれています。すべての手順が完全に詳細に記載されています。アデノウイルスの構築およびウイルス精製は解剖上皮初歩の遺伝形質で使用するための臓器摘出の前に実行する必要があります。アデノウイルスを扱うときは、すべての標準的なBSL-2の安全上の予防措置に従うべきである。 1。マウス胚性顎下腺?...

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	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis:+investigating+growth+factor/matrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development.">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li><li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity.">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li><li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis.">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li><li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

ex vivoでの上皮間葉組換え技術は、1981年に初めて16で顎下唾液腺のために公開されていました。このプロトコルでは、再結合された腺のコンテキスト内で上皮細胞の遺伝子発現を操作するためにアデノウイルス感染を用いて、元のメソッドを拡張。感染している細胞の割合は、ウイルスプロモーターの性質、ウイルス力価およびウイルス純度に依存するのに対し、我々は、上皮...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まないDMEM /ハムF12培地</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 15070-163 </td><td> 10X株式</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 17105-041 </td><td> -20Cで単一使用アリコートを凍結</td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマ</td><td> A2934-100G </td><td>フラクションV、低エンドトキシン</td></tr><tr><td>アデノX-GFP </td><td> BD Biosciences社</td><td> 8138から1 </td><td>高力価（1×10 10 pfu / ml）をする必要があります。セシウム精製ウイルスは、このアッセイにおいて、カラム精製ウイルスよりも効果的です。 </td></tr><tr><td> 16％パラホルムアルデヒド</td><td&gt;電子顕微鏡学</td><td> 15710 </td><td> 5％スクロース（w / v）を含むPBS中2％に希釈</td></tr><tr><td> 1Xリン酸緩衝食塩水（PBS） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 70011-044 </td><td> 10Xストックから調製</td></tr><tr><td>ハンクス液</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 14175095 </td><td>全くカルシウムなし、マグネシウム、無フェノールレッド</td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td>シグマ</td><td> T8158 </td><td> 25ミリグラム/ DMEM/F12メディアにおけるミリリットル原液。 -20Cでシングルユースのアリコートを凍結</td></tr><tr><td> L-アスコルビン酸（ビタミンC） </td><td>シグマ</td><td> A4403 </td><td> -20CでDMEM/F12 media.Freezeシングルユースのアリコートで75 mg / mlの原液</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1。組み換えプロトコルをSMGに必要な試薬のリスト。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 10センチメートル滅菌したプラスチック製の皿</td><td>コー​​ニング</td><td> 430167 </td><td>非組織培養処理プレートを使用することもできます。 </td></tr><tr><td>透過光ベース付きステレオ解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> SMZ645 </td><td>顕微鏡を解剖し、あらゆるステレオ、透過光のベースを持っていることを使用することができます。 </td></tr><tr><td> 35ミリメートルの組織培養皿</td><td>ファルコン</td><td> 353001 </td><td>非組織培養処理プレートを使用することもできます。 </td></tr><tr><td>直径50mmのマイクロウェル皿</td><td>マテック株式会社</td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nucleporeトラックエッチメンブレンフィルター</td><td>ワットマン</td><td> 110405 </td><td>直径13mm、0.1mmの細孔径</td></tr><tr><td>広視野蛍光顕微鏡</td><td>カールツァイス、米国</td><td>アクシオオブザーバーZ1 </td><td>任意の蛍光顕微鏡（直立、Invertedまたはステレオ解剖顕微鏡）添付されたデジタルカメラで低倍率でGFPの発現をモニターするために使用することができます。 </td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> TCS SP5 </td><td>共焦点顕微鏡は、詳細なセル構造を参照してくださいする必要があります。任意の共焦点顕微鏡を使用することができます。 </td></tr><tr><td>時限妊娠雌マウス、ひずみのCD-1またはICR </td><td>チャールズリバー研究所</td><td></td><td>胚は13日（0日として指定されたプラグインの発見の日を含む）に収穫されます。 </td></tr><tr><td>メスの刃＃11 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10011から00 </td><td></td></tr><tr><td>スカルペルハンドル＃3 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10003から12 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子INOX合金、0.05ミリメートルX 0.02ミリメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11252から20 </td><td>胚から腺を収穫するための理想的な</td></tr><tr><td&gt;デュモン＃5鉗子dumostar合金、0.05ミリメートルX 0.01ミリメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11295から20 </td><td>ファインヒントは上皮から間葉を除去するために必要とされる。タングステン針を使用することもできます。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2機器組プロトコルをSMGで使用されます。 </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

分枝形態形成することは、多くの臓器の開発中に発生し、マウス胎児の顎下腺（SMG）は、分枝形態形成の研究のための古典的なモデルである。 -最終的に口腔1に、それぞれ、唾液を生産し、変更/輸送するために役立つ腺やダクトの複雑な分岐鎖のネットワークを生じさせるために、上皮芽とダクト形成のステップを反復開発SMGでは、このプロセスが含まれます3。細胞および分子イベントがコーディネートされている方法が、これらの細胞によって産生される間葉細胞、成長因子や細胞外マトリックスを含む上皮関連基底膜と間葉コンパートメントの側面は、、、、分岐メカニズムに不可欠な貧弱4を理解して残っている。分子メカニズムの研究では、上皮の形態形成の進歩の発達メカニズムの理解を推進し、可能レーゲナーへの洞察を提供ative医学的アプローチ。このような研究は、唾液上皮の遺伝子操作のための効果的な方法が不足しているため妨げられてきた。現在、アデノウイルス形質導入は 、in vivo 5 で成人腺上皮細胞を標的とするための最も効果的な方法を表しています。しかし、胚外植片に、緻密間葉と上皮細胞を取り巻く基底膜は、上皮細胞へのウイルスのアクセスを妨げている。間充織が削除された場合は、上皮はアデノウイルスを用いてトランスフェクトすることができ、および上皮初歩はマトリゲルまたはラミニン-111 6,7の存在下で分岐形態形成を再開することができます。間葉フリー上皮原基の成長はまた、可溶性増殖因子と追加の補充を必要とし、それをそのまま腺8で発生したような完全に分岐形態形成を再現していません。ここでは、トランスフェクトされたeの上皮細胞と文化のアデノウイルス形質導入を容易にする技術を説明関連した間充織とpithelium。胚のサブマシンガン、間葉の除去、およびGFP含有アデノウイルスによる上皮のウイルス感染の顕微解剖に続いて、我々はそのままSMG腺構造をrecapitulatingと分枝形態形成、上皮が自発的に感染していない間充織と再結合することを示している。蛍光タグ付きアデノウイルスコンストラクトが使用されている場合、遺伝的に修飾された上皮細胞集団は簡単に、標準的な蛍光顕微鏡法を使用して監視できます。ここで説明された組織の組換え方法は、現在、トランスジェニック動物の生成を必要としない複雑な3次元組織構築物内に野生型または変異型ベクターを用いた上皮細胞のトランスフェクションのための最も効果的かつアクセス可能な方法である。

主要な実験手順のフローを図1に概説されています。無傷のSMGは、隔離された原基上皮、およびそれに対応する間充織の例を図2に示す。ときに指示された時間のために培養されたex vivoで分岐形態形成を継続して受ける組み換えられたサブマシンガンの明視野像を図3に示す。上皮GFPを発現している48時間成長させ再結合腺が図4</str...

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

遺伝的に全体の内の上皮細胞を操作する技術<em&gt; ex vivoで</emウイルスの遺伝子導入を用いて&gt;培養胚マウス顎下腺（サブマシンガン）が記述されている。この方法では、自発的にアデノウイルスベクターを用いた上皮初歩の分離及び感染後再結合する上皮と間充織をSMGの生得的な能力を活用しています。

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