Name: genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00
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저자는 도움이 의견들과 원고의 중요한 독서 박사 드레 넬슨 감사드립니다. 이 작품은 올 버니에있는 대학 SUNY에 대한 NIH 보조금 DE019244, DE019197, 그리고 DE021841 ML까지, F32DE02098001 SJS까지, C06 RR015464로 운영되었습니다.

프로토콜은 그림 1에 설명 된 네 개의 주요 단계가 포함되어 있습니다. 모든 단계는 전체 자세히 설명되어 있습니다. 아데노 바이러스 건설 바이러스 정화는 해부하는 상피 초보의 유전 형질 도입에 사용하기 위해 장기 수확을 사전에 수행해야합니다. adenoviruses과 함께 작업 할 때 모든 표준 BSL-2 안전 조치를 준수해야합니다. 1. 마우스 배아 턱밑 분비선 (SMG) 수확 ?...

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	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland.">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li><li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development:+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms.">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li><li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. 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M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

예 생체 상피 - 중간 엽 재조합 기술이 처음 1981 16 턱밑 침샘에 출판되었다. 이 프로토콜에서는, 우리는 재결합 선의 컨텍스트 내에서 상피 세포의 유전자 발현을 조작하는 adenoviral 감염를 사용하여 원래의 방법에 따라 확장합니다. 우리는 감염된 세포의 비율은 바이러스 발기인의 속성, 바이러스 titer 및 바이러스 순도에 따라 달라집니다 반면, 상피 세포의 비율은, 아데노 바이러?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 페놀 레드가없는 DMEM / 햄의 F12 중 </td><td> 생명 기술 </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린과 스트렙토 마이신 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15070-163 </td><td> 10X 주식 </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 생명 기술 </td><td> 17105-041 </td><td> 단일 사용 aliquots을 고정에서-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> A2934-100G </td><td> 분수 V, 낮은 내 독소 </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> 높은 titer (1x10 10 PFU / ML) 여야합니다. CsCl 정화 바이러스는이 분석에서 바이러스를 열 정화보다 더 효과적입니다. </td></tr><tr><td> 16 % Paraformaldehyde </td><td&gt; 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td><td> 5 %의 자당 (w / V)와 PBS에서 2 %로 희석 </td></tr><tr><td> 1X 인산 버퍼 생리 (PBS) </td><td> 생명 기술 </td><td> 70011-044 </td><td> 10X 혈통 준비 </td></tr><tr><td> 행크의 균형 소금 솔루션 </td><td> 생명 기술 </td><td> 14175095 </td><td> 더 칼슘도없고, 마그네슘, 아니 페놀 레드 </td></tr><tr><td> 트랜스페린 </td><td> 시그마 </td><td> T8158 </td><td> 25 MG / DMEM/F12 미디어 ML 주식 솔루션입니다. 단일 사용 aliquots에서-20C를 고정 </td></tr><tr><td> L-아스코르브 산 (비타민 C) </td><td> 시그마 </td><td> A4403 </td><td> DMEM/F12 media.Freeze 단일 사용 aliquots 75 MG / ML 주식 솔루션에서-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 재결합 프로토콜을 SMG에 필요한 시약의 목록입니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 10cm 멸균 플라스틱 요리 </td><td> 코닝 </td><td> 430167 </td><td> 비 조직 문화 치료 접시도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 전송 라이트 기반으로 스테레오 해부 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> SMZ645 </td><td> 현미경을 해부 모든 스테레오가 전송 가벼운 기지를 가지고 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 35mm 조직 문화 요리 </td><td> 매 </td><td> 353001 </td><td> 비 조직 문화 치료 접시도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 50mm 직경 microwell 요리 </td><td> MatTek 공사 </td><td> P50-G-1.5 14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore 트랙 - 에칭 막 필터 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 110405 </td><td> 13mm 직경, 0.1 mm 구멍 크기 </td></tr><tr><td> Widefield 형광 현미경 </td><td> 칼 Zeiss, USA </td><td> Axio 옵저버 Z1 </td><td> 모든 형광 현미경 (똑바로, 전) nverted 또는 현미경을 해부 스테레오는 첨부 된 디지털 카메라로 낮은 배율에서 GFP 발현을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 공 촛점 현미경 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> TCS SP5 </td><td> 공 촛점 현미경 자세한 세포 구조를 볼 필요가 있습니다. 모든 공 촛점 현미경을 사용하실 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 시간 제한이 초과 임신 여성 마우스, 스트레인 CD-1 또는 ICR </td><td> 찰스 강 (Charles River) 연구소 </td><td></td><td> 태아는 하루에 13 일 (일 0로 지정 플러그 발견 하루)에 수확하고 있습니다. </td></tr><tr><td> 메스 블레이드 # 11 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> 메스 핸들 # 3 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 포셉 inox 합금, 0.05mm X 0.02mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11252-20 </td><td> 배아에서 분비 수확에 이상적 </td></tr><tr><td&gt; 뒤몽 # 5 포셉 dumostar 합금, 0.05mm X 0.01mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11295-20 </td><td> 좋은 팁 상피에서 mesenchyme을 제거 필요합니다. 텅스텐 바늘도 사용하실 수 있습니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 2. 장비 재결합 프로토콜을 SMG에 사용됩니다. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

morphogenesis을 분기하는 많은 기관의 개발 기간 동안 발생하며, 배아 마우스 턱밑의 선 (SMG)는 morphogenesis을 가지 연구를위한 클래식 모델입니다. - 궁극적으로 구강 하나에 각각 침을 생산 및 수정 / 전송하기 위해 사용될 acini과 관의 복잡한 분지 네트워크에 상승을 제공하기 위해 상피 봉오리 덕트 형성 단계를 반복 개발 SMG,이 과정은 포함 3. 어떻게 세포와 분자 이벤트가 제대로 이해 남아 조정 아르하지만 상피 - 관련 지하 막하고 이러한 세포에 의해 생산 mesenchyme 세포, 성장 인자와 세포 외 기질을 포함하는 중간 엽 구획의 측면은, 분기 메커니즘에 중요한 사 . 분자 메커니즘의 연구는 상피 morphogenesis 진행에게 발달 메커니즘에 대한 우리의 이해를 운전 가능한 regener에 대한 통찰력을 제공합니다ative 의학 접근. 이러한 연구는 침 상피의 유전자 조작에 대한 효과적인 방법의 부족으로 인해 방해되었습니다. 현재 adenoviral 도입은 생체 5 성인 분비에 상피 세포를 타겟팅하는 가장 효과적인 방법을 나타냅니다. 그러나 배아 explants에서 조밀 mesenchyme과 상피 세포를 둘러싸고있는 지하 막는 상피 세포에 바이러스 접근을 막는. mesenchyme가 제거되면, 상피는 adenoviruses를 사용하여 transfected 수 있고, 상피 초보는 Matrigel 또는 laminin-111 6,7의 존재에 morphogenesis을 분기 재개 할 수 있습니다. Mesenchyme 무료 상피 흔적 기관의 성장은 수용성 성장 요인으로 추가 보완이 필요하고 그대로 땀샘 8 발생할 때 완전히 분기 morphogenesis을 요점을 되풀이하지 않습니다. 여기 transfected 전자의 상피 세포와 문화의 adenoviral 전달을 용이하게하는 기술을 설명관련 정보 mesenchyme있는 pithelium. 배아 SMGs, mesenchyme의 제거, 그리고 GFP 함유 아데노 바이러스와 상피의 바이러스 감염의 microdissection 따라, 우리는 상피가 저절로 그대로 SMG 선의 구조를 recapitulating하고 morphogenesis을 분기, 감염되지 않은 mesenchyme과 recombines을 보여줍니다. 유전자 변형 상피 세포 인구는 쉽게 휘황 태그 경우 adenoviral 구조가 사용되는 표준 형광 현미경 방법을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 조직 재조합 방법은 현재 유전자 변형 동물의 생성을 필요로하지 않습니다 복잡한 3D 조직 구조 내에서 야생 형 또는 돌연변이 벡터와 상피 세포의 transfection을위한 가장 효과적이고 접근 방법입니다.

주요 실험 단계의 흐름은 그림 1에 설명되어 있습니다. 그대로 SMG 고립 된 상피 흔적 기관 및 해당 mesenchyme의 예는 그림 2에 표시됩니다. 지정된 시간에 대한 양식 예를 생체가 그림 3에 표시됩니다 때 morphogenesis을 분기 받아야 계속 재결합 SMGs의 Brightfield 이미지. 상피 GFP를 표현하는 48 시간에 성장 재결합 분비가 그림 4에 표시됩니다....

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

유전자 전체에서 상피 세포를 조작하는 기술<em&gt; 예 생체</em바이러스 성 유전자 전달을 사용하여&gt; 교양 배아 마우스 턱밑의 분비 (SMGs)이 설명되어 있습니다. 이 방법은 상피와 자발적으로 adenoviral 벡터와 상피 초보의 분리 및 감염 후 재결합 할 수 mesenchyme을 SMG의 본래 기능을 활용합니다.

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