Name: genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke dr. Deirdre Nelson for nyttige kommentarer og for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd DE019244, DE019197, og DE021841 til ML, F32DE02098001 til SJS, og C06 RR015464 til Universitetet i Albany, SUNY.

Protokollen inneholder fire hovedtrinn, som avbildet i figur 1.. Alle trinn er beskrevet i detalj. Adenovirus konstruksjon og viral rensing bør utføres i forkant av organrøveri for bruk i den genetiske transduksjon av dissekert epiteliale rudimenter. Alle standard BSL-2 sikkerhetsregler bør følges når man jobber med adenoviruses. 1. Mus Embryonic submandibular kjertel (SMG) Høsting og mikrodisseksjon <ol><li> Avlive tidsstyrt gravide hunnmus (outbred stamme CD-en el...

<ol>
	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland.">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li><li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development:+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms.">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li><li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis:+investigating+growth+factor/matrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development.">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li><li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+collagen.">The chemistry and biology of collagen.</a> The Proteins. 4, 412-632 (1979).</li><li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin,+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture.">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity.">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li><li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis.">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li><li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

Den tidligere vivo epitelial-mesenchymale rekombinasjon teknikken ble først publisert for submandibular spyttkjertler i 1981 16. I denne protokollen, utvider vi på den opprinnelige metoden med adenoviral infeksjon å manipulere epitelcelleopprinnelse genuttrykk innenfor rammen av en rekombinert kjertel. Vi viser at en prosentandel av epitelcellene er infisert med adenovirus, mens prosentandelen av celler som er infisert avhenger egenskapene til viral promotor, viral titer, og viral renhet. Vi har f...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på Reagent </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 Medium uten fenolrødt </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin og streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> 10X lager </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Frys engangsbruk alikvoter ved-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fraksjon V, lav endotoksiner </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Bør være høy titer (1x10 10 pfu / ml). CSCL rensede virus er mer effektive enn kolonne-renset virus i denne analysen. </td></tr><tr><td> 16% paraformaldehyd </td><td&gt; Elektronmikroskopi Sciences </td><td> 15710 </td><td> Fortynnet til 2% i PBS med 5% sukrose (vekt / volum) </td></tr><tr><td> 1X fosfatbufret saltvann (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Fremstilt fra 10X lager </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> ingen kalsium, ingen Magnesium, ingen fenolrødt </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml stamoppløsning i DMEM/F12 medier. Frys engangsbruk alikvoter ved-20C </td></tr><tr><td> L-askorbinsyre (vitamin C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml stamoppløsning i DMEM/F12 media.Freeze engangsbruk alikvoter ved-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 1. Liste over reagenser som kreves for SMG rekombinasjon protokollen. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm sterile plast retter </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Ikke-vevskultur-behandlede plater kan også benyttes. </td></tr><tr><td> Stereo disseksjonsmikroskop med overført lys base </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Enhver stereo disseksjonsmikroskop kan brukes som har en overførte lys base. </td></tr><tr><td> 35 mm vev kultur retter </td><td> Falk </td><td> 353001 </td><td> Ikke-vevskultur-behandlede plater kan også benyttes. </td></tr><tr><td> 50 mm diameter mikrobrønn retter </td><td> Mattek Corporation </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch membranfiltre </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> 13 mm diameter, 0,1 mm porestørrelse </td></tr><tr><td> Widefield fluorescensmikroskop </td><td> Carl Zeiss, USA </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Enhver fluorescens mikroskop (oppreist, jegnverted eller stereo disseksjonsmikroskop) kan brukes til å overvåke GFP uttrykk ved lav forstørrelse med et vedlagt digitalkamera. </td></tr><tr><td> Confocal mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Konfokalmikroskopi er nødvendig å se detaljerte cellestrukturer. Hvilkensomhelst konfokal mikroskop kan brukes. </td></tr><tr><td> Tidsstyrt gravide hunnmus, stamme CD-en eller ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Embryoer høstes på dag 13 (med dag av plug funn utpekt som dag 0). </td></tr><tr><td> Skalpell blad nr. 11 </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Skalpell håndtak nr. 3 </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 tang inox legering, 0.05mm X 0,02 mm </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11252-20 </td><td> Ideell for høsting kjertler fra embryo </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 tang dumostar legering, 0.05mm X 0.01mm </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11295-20 </td><td> Fin tips kreves for fjerning mesenchyme fra epitel. Tungsten nåler kan også brukes. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 2. Utstyr som brukes i SMG rekombinasjon protokollen. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Forgrening morphogenesis oppstår under utviklingen av mange organer, og embryonale mus submandibular kjertel (SMG) er en klassisk modell for studiet av forgrening morphogenesis. I utviklingsland SMG, innebærer denne prosessen iterative trinn epitelisk knopp og kanalsystem formasjon, til slutt gir opphav til et komplekst forgrenet nettverk av acini og kanaler, som tjener til å produsere og modifisere / transportere spytt, henholdsvis inn i munnhulen 1 - 3. Epiteliale-assosiert basalmembran og aspekter ved mesenchymale kupeen, inkludert mesenchyme cellene, vekstfaktorer og den ekstracellulære matrix, produsert av disse celler, er avgjørende for den forgrenede mekanismen, selv hvor de cellulære og molekylære hendelser koordineres forblir dårlig forstått 4 . Studiet av de molekylære mekanismene kjører epiteliale morphogenesis fremskritt vår forståelse av utviklingsmessige mekanismer og gir innsikt i mulige regenerativAtive medisin tilnærminger. Slike studier har blitt hemmet på grunn av mangel på effektive metoder for genetisk manipulasjon av salivary epitel. For tiden representerer adenoviral transduksjon den mest effektive metoden for målretting epitelceller i voksen kjertler in vivo 5. Imidlertid i embryonale eksplanter, hemmer tett mesenchyme og basalmembran omgir epitelceller viral tilgang til epitelceller. Dersom mesenchyme er fjernet, kan epitelet bli transfektert med adenovirus, og epiteliale rudimenter kan gjenoppta branching morphogenesis i nærvær av Matrigel eller laminin-111 6,7. Mesenchyme-free epitelial rudiment vekst krever også ekstra tilskudd med oppløselige vekstfaktorer og ikke fullt rekapitulere forgrening morphogenesis som det skjer i intakte kjertler 8. Her beskriver vi en teknikk som letter adenovirale transduksjon av epitelceller og kultur av transfekterte epithelium med tilhørende mesenchyme. Etter mikrodisseksjon av embryonale maskingeværer, fjerning av mesenchyme, og viral infeksjon i epitelet med en GFP-holdig adenovirus, viser vi at epitelet spontant recombines med infisert mesenchyme, rekapitulere intakt SMG glandular struktur og forgrening morphogenesis. Den genmodifiserte epitelcelleopprinnelse befolkningen kan lett overvåkes ved hjelp av standard fluorescens mikroskopi metoder, hvis fluorescently-merket adenovirale konstruerer brukes. Vevet rekombinasjon metoden beskrevet her er for tiden den mest effektive og tilgjengelige metode for transfeksjon av epitelceller med en vill-type eller mutert vektor i en kompleks 3D vev konstruere som ikke krever generering av transgene dyr.

Flyten av de store eksperimentelle trinnene er skissert i Figur 1. Et eksempel på en intakt SMG, en isolert epitelial rudiment, og dens tilhørende mesenchyme er vist i figur 2. Lysfelt bilder av rekombinerte maskingeværer, som fortsetter å gjennomgå forgrening morphogenesis når kultivert ex vivo for de angitte tider, er vist i figur 3. Rekombinerte kjertler dyrket i 48 timer uttrykker epitelial GFP er vist i figur 4. Confocal bilder av re...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

En teknikk for å genetisk manipulere epitelceller i hele<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kulturperler embryonale mus submandibular kjertler (maskingeværer) ved hjelp av viral genoverføring er beskrevet. Denne metoden tar fordel av medfødt evne SMG epitel og mesenchyme å spontant rekombinerer etter separasjon og infeksjon epiteliale barnelærdom med adenovirale vektorer.

Genmodifisering og Rekombinasjon av spyttkjertel Organ kulturer

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

DNA metylering: Bisulphite Modifikasjon og analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Tilberedning av Mgm101 rekombinasjon Protein av MBP-baserte Tagging Strategi

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative Kulturer til human pluripotent Stem Cell produksjon, vedlikehold, og Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, Isolering og Imaging av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...