Name: genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Дейдра Нельсон за полезные замечания и критическое чтение рукописи. Эта работа финансировалась грантами NIH DE019244, DE019197, и DE021841 к ML, F32DE02098001 к SJS, и C06 RR015464 в университете в Олбани, штата Нью-Йорк.

Протокол содержит четыре основных шага, как показано на рисунке 1. Все действия описаны во всех подробностях. Строительство аденовирус и вирусных очистки должны быть выполнены до начала извлечения органов для использования в генетической трансдукции расчлененный эпителиаль...

<ol>
	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland.">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li><li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development:+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms.">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li><li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis:+investigating+growth+factor/matrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development.">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li><li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+collagen.">The chemistry and biology of collagen.</a> The Proteins. 4, 412-632 (1979).</li><li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin,+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture.">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity.">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li><li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis.">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li><li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

Экс естественных эпителиальных мезенхимальных рекомбинации техника была впервые опубликована в подчелюстной слюнной железы в 1981 16. В этом протоколе, мы расширяем на оригинальный метод, с помощью аденовирусной инфекции манипулировать эпителиальные клетки экспрессии генов...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> DMEM / Хэма &quot;с F12 среде без фенола красного </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Пенициллина и стрептомицина </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> 10X складе </td></tr><tr><td> Диспазы </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Замораживание одной порции использования на-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Сигма </td><td> A2934-100G </td><td> Доля V, низкий эндотоксина </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Должен быть высокий титр (1x10 10 БОЕ / мл). CsCl очищенного вируса являются более эффективными, чем столбцов очищенных вирусов в этом анализе. </td></tr><tr><td> 16% параформальдегид </td><td&gt; Электрон наук микроскопии </td><td> 15710 </td><td> Разводненная прибыль на 2% в PBS с 5% сахарозы (вес / объем) </td></tr><tr><td> 1X фосфат-солевым буфером (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Получают из 10х складе </td></tr><tr><td> Сбалансированный солевой Хэнка решение </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> нет кальция, магния нет, не Фенол красный </td></tr><tr><td> Трансферрин </td><td> Сигма </td><td> T8158 </td><td> 25 мг / мл маточного раствора в DMEM/F12 СМИ. Замораживание одноразовые аликвоты при-20C </td></tr><tr><td> L-аскорбиновая кислота (витамин С) </td><td> Сигма </td><td> A4403 </td><td> 75 мг / мл маточного раствора в DMEM/F12 media.Freeze одноразовые аликвоты при-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Таблица 1. Список реагенты для SMG рекомбинации протокол. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 см стерильная посуда пластиковая </td><td> Гранулирование </td><td> 430167 </td><td> Номера для культуры тканей обработанных пластин также может быть использован. </td></tr><tr><td> Stereo рассекает микроскопом в проходящем свете базу </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Любой стерео рассекает микроскоп может быть использован, который имеет проходящем свете базу. </td></tr><tr><td> 35 мм блюд культуре ткани </td><td> Сокол </td><td> 353001 </td><td> Номера для культуры тканей обработанных пластин также может быть использован. </td></tr><tr><td> Диаметром 50 мм микролуночные блюд </td><td> Маттек корпорации </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore трек-Etch мембранные фильтры </td><td> Ватман </td><td> 110405 </td><td> Диаметром 13 мм, 0,1 мм, размер пор </td></tr><tr><td> Широкоугольные флуоресцентного микроскопа </td><td> Carl Zeiss, США </td><td> Axio наблюдателей Z1 </td><td> Любой флуоресцентного микроскопа (в вертикальном положении, яnverted или стерео рассекает микроскопом) может быть использован для мониторинга GFP выражение при небольшом увеличении с приложенной цифровой камеры. </td></tr><tr><td> Конфокальной микроскопии </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Конфокальной микроскопии необходимо, чтобы увидеть подробную клеточных структур. Любой конфокальной микроскопии может быть использована. </td></tr><tr><td> Временный беременных самок мышей, штамм CD-1 или ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Эмбрионы собирали в день 13 (с днем ​​плагин открытия обозначен как день 0). </td></tr><tr><td> Лезвие скальпеля № 11 </td><td> Средства изобразительных наук </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Скальпель ручкой № 3 </td><td> Средства изобразительных наук </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Дюмон # 5 пинцет из нержавеющей стали сплава, 0,05 X 0,02 мм </td><td> Средства изобразительных наук </td><td> 11252-20 </td><td> Идеально подходит для уборки желез из эмбрионов </td></tr><tr><td&gt; Дюмон # 5 щипцы dumostar сплав, 0,05 X 0,01 мм </td><td> Средства изобразительных наук </td><td> 11295-20 </td><td> Изобразительное советы, необходимые для удаления мезенхимы из эпителия. Вольфрам иглы также может быть использован. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Таблица 2. Оборудование, используемое в SMG рекомбинации протокол. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

Поток из основных экспериментальных шагов указаны на рисунке 1. Пример нетронутыми SMG, изолированных эпителиальных зачатков, и соответствующий мезенхимы показано на рисунке 2. Светлое изображение рекомбинированных пистолетов-пулеметов, которые продолжают подвергат...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Техника генетически манипулировать эпителиальных клеток в целом<em&gt; Бывших естественных условиях</em&gt; Культурной эмбриональных подчелюстной железы мыши (SMG) с помощью вирусного переноса генов описано. Этот метод использует врожденные способности SMG эпителия и мезенхимы спонтанно рекомбинировать после разделения и инфекции эпителиальных зачатков с аденовирусных векторов.

Генетическая модификация и рекомбинации слюнных желез органной культуры

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Препарирование Средняя кишка и слюнных желез от Ae. aegypti комаров

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS изготовление устройств и модификации поверхности

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Получение 2-dGuo обработанных Thymus культур Органный

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Выделение мышью слюнных желез стволовых клеток

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Метилирования ДНК: Модификация бисульфита и анализа

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Подготовка Mgm101 рекомбинации белка на основе МВР тегов стратегии

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Альтернативные Культуры для человека плюрипотентных стволовых клеток производство, техобслуживание, и генетический анализ

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...