Name: genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Deirdre Nelson för hjälpsamma kommentarer och kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag DE019244, DE019197 och DE021841 till ML, F32DE02098001 till SJS och C06 RR015464 till universitetet i Albany, SUNY.

Protokollet innehåller fyra stora steg, som visas i figur 1. Alla steg beskrivs i detalj. Adenovirus konstruktion och viral rening bör utföras i förväg om organstölder för användning i den genetiska transduktion av de dissekerade epiteliala grunderna. Alla standard BSL-2 försiktighetsåtgärder bör följas vid arbete med adenovirus. 1. Mus embryonala submandibulär Gland (SMG) Skörd och mikrodissektion <ol><li> Avliva tidsinställda-gravida honmöss (utavlat sta...

<ol>
	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland.">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li><li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development:+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms.">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li><li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis:+investigating+growth+factor/matrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development.">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li><li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+collagen.">The chemistry and biology of collagen.</a> The Proteins. 4, 412-632 (1979).</li><li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin,+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture.">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity.">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li><li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis.">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li><li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

Ex vivo epitel-mesenkymala rekombinationsteknik publicerades först på submandibulära spottkörtlar 1981 16. I detta protokoll utöka vi på den ursprungliga metoden, med hjälp av adenoviral infektion för att manipulera epitelial uttryck cell genen inom ramen för en rekombinerad körtel. Vi visar att en andel av de epiteliala cellerna infekteras med adenovirus, medan procentandelen av celler som är infekterade beror på egenskaperna hos den virala promotorn, viral titer, och viral renhet. Vi ha...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 medium utan fenolrött </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin och streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> 10X lager </td></tr><tr><td> Dispas </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Freeze engångsbruk alikvoter vid-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fraktion V, lågt endotoxin </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Bör vara hög titer (1x10 10 pfu / ml). CsCl-renade virus är mer effektiva än kolonn-renade virus i denna analys. </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td&gt; Electron Microscopy Sciences </td><td> 15.710 </td><td> Utspädd till 2% i PBS med 5% sackaros (vikt / volym) </td></tr><tr><td> 1X Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Framställd från 10X lager </td></tr><tr><td> Hanks balanserade saltlösning </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> ingen Kalcium, magnesium ingen, ingen fenolrött </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml förrådslösning i DMEM/F12 medium. Freeze engångsbruk alikvoter vid-20C </td></tr><tr><td> L-askorbinsyra (vitamin C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml förrådslösning i DMEM/F12 media.Freeze engångsbruk alikvoter vid-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 1. Lista med reagenser som krävs för SMG rekombination protokollet. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm sterila plastskålar </td><td> Corning </td><td> 430.167 </td><td> Icke-vävnadskultur-behandlade plattor kan också användas. </td></tr><tr><td> Stereo dissekera mikroskop med genomlysningsbas </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> En stereo dissektionsmikroskop kan användas som har en ljus bas. </td></tr><tr><td> 35 mm vävnads odlingsplattor </td><td> Falcon </td><td> 353.001 </td><td> Icke-vävnadskultur-behandlade plattor kan också användas. </td></tr><tr><td> 50 mm diameter mikrobrunnar skålar </td><td> Mattek Corporation </td><td> P50-G-1,5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch membranfilter </td><td> Whatman </td><td> 110.405 </td><td> 13 mm i diameter, 0,1 mm porstorlek </td></tr><tr><td> Widefield fluorescensmikroskop </td><td> Carl Zeiss, USA </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Varje fluorescensmikroskop (upprätt, jagnverted eller stereo dissektionsmikroskop) kan användas för att övervaka GFP-expression vid låg förstoring med en bifogad digital kamera. </td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Konfokalmikroskopi är nödvändig för att se detaljerade cellstrukturer. Varje konfokalmikroskop kan användas. </td></tr><tr><td> Timed-gravida honmöss, stam CD-1 eller ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Embryon skördas på dag 13 (med dag av plugg upptäckt betecknas som dag 0). </td></tr><tr><td> Skalpellblad # 11 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Skalpellhandtaget # 3 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pincett inox legering, 0.05mm X 0,02 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-20 </td><td> Idealisk för skörd körtlar från embryon </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 pincett dumostar legering, 0.05mm X 0.01mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.295-20 </td><td> Fina tips för demontering mesenkym från epitel. Volfram nålar kan också användas. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 2. Utrustning som används vid SMG rekombination protokollet. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Förgrening morfogenes sker under utvecklingen av många organ, och den embryonala mus submandibular körtel (SMG) är en klassisk modell för att studera förgrening morfogenes. I utvecklingsländerna SMG innebär denna process iterativa steg epitelial knopp och kanal bildning, för att slutligen ge upphov till ett komplext förgrenad nätverk av acini och kanaler, som tjänar till att producera och modifiera / transportera saliv respektive in i munhålan 1 - 3. Den epitel-associerad basalmembranet och aspekter av den mesenkymala facket, inklusive mesenkymceller, tillväxtfaktorer och extracellulära matrix, som produceras av dessa celler är avgörande för förgrening mekanismen, men hur de cellulära och molekylära händelser samordnas fortfarande dåligt känd 4 . Studien av de molekylära mekanismerna driver epiteliala morfogenes förskott vår förståelse av utvecklingsstörningar mekanismer och ger en inblick i eventuella Regenertiva medicin metoder. Sådana studier har hindrats på grund av brist på effektiva metoder för genetisk manipulation av saliv epitel. För närvarande representerar adenoviral transduktion den mest effektiva metoden för inriktning epitelceller hos vuxna körtlar in vivo 5. Men i embryonala explantat, hindrar tät mesenkym och basalmembranet som omger epitelcellerna virala tillgång till de epiteliala cellerna. Om mesenkym avlägsnas, kan epitelet transfekteras med adenovirus, och epiteliala grunderna kan återuppta förgrening morfogenes i närvaro av Matrigel eller laminin-111 6,7. Mesenkym-fri epitelial rudiment tillväxt kräver också ytterligare tillskott med lösliga tillväxtfaktorer och inte helt rekapitulera förgrening morfogenes som förekommer i intakta körtlar 8. Här beskriver vi en teknik som underlättar adenoviral transduktion av epitelceller och kultur transfekterade epithelium med tillhörande mesenkym. Efter mikrodissektion av de embryonala SMGs, avlägsnande av mesenkym, och viral infektion av epitelet med en GFP-innehållande adenovirus, visar vi att epitelet spontant rekombinerar med oinfekterade mesenkym, återupplever intakt SMG glandulär struktur och förgrening morfogenes. Den genetiskt modifierade epitelial cellpopulation kan lätt övervakas med användning av standardmetoder fluorescensmikroskopi metoder, om fluorescens-märkta adenovirala konstruktioner används. Vävnaden rekombination som beskrivs här är för närvarande den mest effektiva och tillgängliga metod för transfektion av epitelceller med en vildtyp eller mutant vektor inom en komplex 3D vävnad konstruktion som inte kräver generering av transgena djur.

Flödet av de stora experimentella steg skisseras i Figur 1. Ett exempel på en intakt SMG, en isolerad epitelial rudiment, och dess motsvarande mesenkym visas i figur 2. Brightfield bilder av rekombinerade SMGs, som fortsätter att genomgå förgrening morfogenes när odlade ex vivo under de angivna tiderna, visas i figur 3. Rekombinerade körtlar odlas för 48 timmar uttrycker epitelial GFP visas i figur 4. Konfokala bilder av rekombinerade S...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

En teknik för att genetiskt manipulera epitelceller i hela<em&gt; Ex vivo</em&gt; Odlade embryonala mus submandibulära körtlar (SMGS) med viral genöverföring beskrivs. Denna metod utnyttjar den inneboende förmågan hos SMG epitel och mesenkym att spontant rekombinera efter separation och infektion av epiteliala anlag med adenovirusvektorer.

Genetisk modifiering och rekombination av saliv kulturer Gland Organ

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissekering av midgut och spottkörtlar från AE. aegypti Myggor

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS Komponentframställning och ytmodifiering

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Metod för kultur av tidig kycklingembryon ex vivo (New Kultur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbel Hela Montera in situ hybridisering för tidig kycklingembryon

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Beredning av 2-dGuo-behandlade Thymus Organ kulturer

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolering av Mouse Saliv celler Gland Stem

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

DNA-metylering:, dock Ändring och analys

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Beredning av Mgm101 rekombinationsprotein av MBP-baserade taggning strategi

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternativa kulturer för Human pluripotenta stamceller Produktion, underhåll, samt genetisk analys

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, isolering och avbildning av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...