Name: an in vivo assay to test blood vessel permeability
Uploaded: 2013-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health, R01CA142928.

1. Intravenøs injektion af Evans Blue i mus laterale halevene <ol><li> Der fremstilles en 0,5% steril opløsning af Evans blåt i PBS. Om nødvendigt filter-sterilisere opløsningen til fjernelse af eventuelle partikler, der ikke opløses. </li><li> Aspirer 200 pi Evans Blue opløsning i en sprøjte. Undgå alle luftbobler, der kunne have sluppet ind i sprøjten. </li><li> Place-mus, der er 8-12 uger gamle i en fastspændingsanordning således at dyret ikke er frit bevægelig, men halen kan håndteres. </li><li> Plac...

<ol>
	<li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+NO+synthase:+role+in+cellular+signaling.">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li><li>Bertglia, S., Giusti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+capillary+perfusion+and+oxygen+delivery+regulation+during+systemic+hypoxia.">Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+reactions+to+histamine,+histamine-liberator+and+leutaxine+in+the+skin+of+guinea+pigs.">Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs.</a> J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).</li><li>Weis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+in+cardiovascular+disease+and+cancer.">Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer.</a> Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).</li><li>Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+endothelial+hyperpermeability:+implications+in+inflammation.">Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation.</a> Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).</li><li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+blood+pressure,+and+organ+damage+in+primary+hypertension.">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).</li><li>Scheppke, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2/Src+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits.">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).</li><li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CD34+Leads+To+Exacerbated+Autoimmune+Arthritis+through+Increased+Vascular+Permeability.">Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability.</a> J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).</li><li>Dvorak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-derived+mediators+of+enhanced+microvascular+permeability,+vascular+permeability+factor/vascular+endothelial+growth+factor,+histamine,+and+serotonin,+cause+leakage+of+macromolecules+through+a+new+endothelial+cell+permeability+organelle,+the+vesiculo-vacuolar+organelle.">Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle.</a> Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).</li><li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability.">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li><li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+"endothelium".">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li></ol>

Vaskulær permeabilitet er en kritisk markør for blodkar status. Forøget vaskulær permeabilitet har vist sig at være til stede i adskillige systemiske sygdomme, herunder diabetes, hypertension og autoimmune sygdomme 6,7,8. Forøget vaskulær permeabilitet har vist sig at være medieret af forskydningsspænding, vækstfaktorer såsom vaskulær endotelvækstfaktor og fibroblastvækstfaktor, inflammatoriske mediatorer som serotonin, histamin og bradykinin 9. Ekstravasation af vand og små molekyle...

Dannelse og vedligeholdelse af selektive permeable barrierer er afgørende for korrekt orgel udvikling og resultater 1,2. Endotelceller line blodkarret lumen og danner en semipermeabel barriere, som er afgørende i den selektive transport mellem blod og det interstitielle rum af alle organer. En passende permeabilitetsbarriere opretholdes gennem stramme celle-til-celle-kryds, som er strengt kontrolleret af vækstfaktorer, cytokiner og andre stressrelaterede molekyler tre. Afbrydelse af den endotelcelle-barrieren kan resultere i øget permeabilitet og vaskulær lækage. Disse virkninger ses i forskellige sygdomstilstande og forståelsen af den understregningen molekylære signalering kræver tværfaglige metoder 4,5. I denne artikel beskriver vi en in vivo metode til at måle fartøj permeabilitet ved hjælp af en musemodel. Assayet vi beskriver, også kendt som Miles-assay, er et godt established metode til at teste vaskulær permeabilitet in vivo. Assayet er baseret på det faktum, at, under basale fysiologiske betingelser, er albumin ikke krydse den endotele barriere. Evans Blue, et azofarvestof med høj affinitet for albumin, indsprøjtes i blodstrømmen i et forsøgsdyr, og under fysiologiske betingelser, forventes den at være begrænset i blodkar. Når en vaskulær permeabilitet stimulus tilsættes, enten topisk eller systemisk, blodkar begynder at lække protein og dermed også Evans-blåt, der er bundet til albumin. Dette resulterer i en hurtig blålig farvning af væv, der har permeable fartøjer. Vellykket injektion af farvestoffet i mus laterale halevene er kritisk for godt resultat af forsøget. Haleveneinjektion teknik kræver omfattende praksis og bør beherskes før du starter eksperimentet. Fartøjets permeabilitet er meget afhængig af alderen og vægten af ​​enimal, så når man sammenligner forskellige musestammer er det bydende nødvendigt, at de mus eller andre forsøgspersoner har tæt på identiske fødselsdatoer og vægt. Andre faktorer, der påvirker permeabiliteten af ​​den endotheliale barriere er miljømæssige forhold såsom temperatur, luftfugtighed, og meget vigtigt, håndtering stress på musen. På grund af de mange faktorer, der kan påvirke resultatet af forsøget er det altid tilrådeligt at eksperimentet gentages mindst tre gange og statistiske analyser udført. Dette assay kan anvendes, eller for at sammenligne kar permeabiliteten af ​​mus, der er blevet genetisk modificeret, samt mus med forskellige genetiske baggrunde. Permeabilitet kan vurderes i nærvær eller fravær af en stimulus, afhængigt af funktionen af ​​genet, der er moduleret. Dette assay kan også anvendes, eller til at teste virkningen af ​​forskellige forbindelser på fartøjet permeabilitet.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENS </td></tr><tr><td> Evans Blue </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> FORMAMID </td><td> INVITROGEN </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 0,2 M Phosphate 1,5 M NaCI pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> UDSTYR </td></tr><tr><td> Spektrofotometer </td><td> EPPENDORF </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> MOUSE fastspændingsanordning </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340.012 </td><td></td></tr><tr><td> INJEKTIONSSPRØJTE </td><td> BD </td><td> 309.659 </td><td></td></tr><tr><td> KANYLER </td><td> BD </td><td> 305.106 </td><td> Profilet af nålen afhænger af størrelsen af ​​dyret. </td></tr><tr><td> BALANCE </td><td> DENVER INSTRUMENT </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo assay to test blood vessel permeability

Denne metode er baseret på den intravenøse injektion af Evans Blue i mus som forsøgsdyr model. Evans blåt er et farvestof, som binder albumin. Under fysiologiske betingelser endotelet er uigennemtrængelig for albumin, så Evans Blue bundne albumin rester restriktioner i blodkar. I patologiske tilstande, der fremmer forøget vaskulær permeabilitet endotelceller delvist mister den tætte kontakt og endotelet bliver permeabel for små proteiner, såsom albumin. Denne betingelse giver mulighed for ekstravasation af Evans Blue i væv. En sund endotel forhindrer ekstravasation af farvestoffet i de omkringliggende vaskulariserede væv. Organer med forøget permeabilitet vil vise signifikant forøget blåfarvning i forhold til organer med intakt endothelium. Niveauet af vaskulær permeabilitet kan bestemmes ved simpel visualisering eller ved kvantitativ måling af farvestoffet inkorporeret milligram af væv af kontrol versus forsøgsdyr / væv. To powerful aspekter af dette assay er dens enkelhed og kvantitative egenskaber. Evans Blue farvestoffet kan ekstraheres fra væv ved inkubation af en særlig mængde væv i formamid. Evans Blue absorbansmaksimum er på 620 nm og absorbansen minimum er på 740 nm. Ved anvendelse af en standardkurve for Evans Blue, kan målinger af optisk densitet omdannes til milligram farvestof fanget milligram af væv. Statistisk analyse bør anvendes til at vurdere signifikante forskelle i vaskulær permeabilitet.

Vi brugte en in vivo permeabilitet assay til at teste fartøj lækage i mus 8-12 uger gamle. Denne test er anvendelig til at sammenligne den relative vaskulær permeabilitet mellem dyr med forskellig genetisk baggrund eller i en enkelt stamme af mus udsat for behandlinger, der påvirker vaskulaturen. Vores resultater viser, at en stamme af genetisk modificerede mus vi skabt i vort laboratorium har en mere permeabel endotel sammenlignet med vildtypemus. Disse ændringer er tydelige på makroskopisk nive...

Watch this Scientific Journal Video about An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability at JoVE.com

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Vi præsenterer et<em&gt; In vivo</em&gt; Assay til at teste blodkar permeabilitet. Dette assay er baseret på intravenøs injektion af et farvestof og efterfølgende visualisering af dets diffusion ind i interstitielle rum.

En<em&gt; In vivo</em&gt; Assay til Test Blood Vessel Permeabilitet

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Kemoterapi-induceret vaskulær toksicitet - Real-time<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af Vessel Nedskrivninger

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs at vurdere slimhinder permeabilitet i modeller af gastrointestinal sygdom

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

I Vitro Assays at vurdere blod-hjerne barriere mesh-lignende fartøj dannelse og afbrydelse

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

4-fartøjets prøveudtagning til integrerende studier af human placental fysiologi<em&gt; In vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

En kronisk hjerte iskæmi Model i svin ved hjælp af en Ameroid kvælerslange

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re Arterialized rotte delvis lever Transplantation med en i vivo fartøj-orienterede 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

En In Vivo metode til evaluering af Gut-blod barriere og lever metabolisme af mikrobiota produkter

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Måling af strial blodgennemstrømning i musecochlea ved hjælp af et åbent karvindue og intravital fluorescensmikroskopi

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Precision Cut Lung Slices som et effektivt værktøj til Ex vivo Pulmonal Vessel Structure og Contractility Studies

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...