Name: an in vivo assay to test blood vessel permeability
Uploaded: 2013-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health, R01CA142928.

1. Intravenøs injeksjon av Evans Blue i Mouse Lateral halevenen <ol><li> Forberede en 0,5% steril løsning av Evans blå i PBS. Om nødvendig, filter-sterilisere løsningen for å fjerne eventuelle partikler som ikke har løst seg opp. </li><li> Aspirer 200 ul Evans Blue løsning i en sprøyte. Unngå alle luftbobler som kan ha rømt inn i sprøyten. </li><li> Sted mus som er 8-12 uker gamle i en tilbakeholdenhet enheten slik at dyret ikke er fritt mobil, men halen kan håndteres. </li><li> Plasser musen tilbakeholde...

<ol>
	<li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+NO+synthase:+role+in+cellular+signaling.">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li><li>Bertglia, S., Giusti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+capillary+perfusion+and+oxygen+delivery+regulation+during+systemic+hypoxia.">Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+reactions+to+histamine,+histamine-liberator+and+leutaxine+in+the+skin+of+guinea+pigs.">Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs.</a> J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).</li><li>Weis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+in+cardiovascular+disease+and+cancer.">Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer.</a> Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).</li><li>Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+endothelial+hyperpermeability:+implications+in+inflammation.">Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation.</a> Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).</li><li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+blood+pressure,+and+organ+damage+in+primary+hypertension.">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).</li><li>Scheppke, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2/Src+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits.">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).</li><li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CD34+Leads+To+Exacerbated+Autoimmune+Arthritis+through+Increased+Vascular+Permeability.">Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability.</a> J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).</li><li>Dvorak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-derived+mediators+of+enhanced+microvascular+permeability,+vascular+permeability+factor/vascular+endothelial+growth+factor,+histamine,+and+serotonin,+cause+leakage+of+macromolecules+through+a+new+endothelial+cell+permeability+organelle,+the+vesiculo-vacuolar+organelle.">Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle.</a> Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).</li><li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability.">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li><li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+"endothelium".">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li></ol>

Vaskulær permeabilitet er en kritisk markør for blodkar status. Økt vaskulær permeabilitet er vist å være til stede i flere systemiske sykdommer, som diabetes, hypertensjon og autoimmune sykdommer 6,7,8. Økt vaskulær permeabilitet er vist å være mediert av skjærspenning, vekstfaktorer som vaskulær endotelial vekstfaktor og fibroblast vekstfaktor, inflammatoriske mediatorer som serotonin, histamin og bradykinin 9. Ekstravasasjon av vann og små molekyler er tenkt å skje gjennom små åp...

Dannelse og vedlikehold av selektive permeable barrierer er avgjørende for riktig organ utvikling og ytelse 1,2. Endotelceller linje blodkaret lumen og danne en semi-permeabel barriere som er vesentlig i selektiv transport mellom blod og den interstitielle rommet av alle organer. En tilstrekkelig permeabilitet barriere opprettholdes gjennom trange celle-til-celle kryss som er strengt kontrollert av vekstfaktorer, cytokiner og andre stressrelaterte molekyler 3. Forstyrrelse av endotelcelle barriere kan føre til økt permeabilitet og vaskulær lekkasje. Disse effektene er sett i ulike sykdomstilstander og forståelse av understrekingen molekylære signaler krever tverrfaglig metoder 4,5. I denne artikkelen beskriver vi en in vivo metode for å måle fartøyets permeabilitet ved hjelp av en mus modell. Analysen vi beskriver, også kjent som Miles analysen, er en godt established metode for å teste vaskulær permeabilitet in vivo. Forsøket er basert på det faktum at under basale fysiologiske betingelser, ikke albumin ikke krysse endoteliale barrieren. Evans Blue, et azo fargestoff med høy affinitet for albumin, blir injisert i blodstrømmen av et forsøksdyr, og under fysiologiske betingelser, er det forventet å være begrenset i blodkar. Når en vaskulær permeabilitet stimulans tilsettes enten topisk eller systemisk, blodkar begynner å lekke protein og således, også Evans blått som er bundet til albumin. Dette resulterer i en hurtig blålig farge av vev som har permeable fartøy. Vellykket injeksjon av fargestoffet i musen lateral halevenen er kritisk for godt resultat av forsøket. Halevenen injeksjonsteknikk trenger omfattende praksis og bør mestret før start av eksperimentet. Fartøy permeabilitet er avhengig av alder og vekten av enimal, så når man sammenligner ulike musestammer er det viktig at de mus eller andre forsøkspersoner har nærmere identiske fødselsdatoer og vekt. Andre faktorer som påvirker permeabilitet endothelial barrieren er miljømessige forhold som temperatur, fuktighet, og svært viktig, håndtering stress av musen. På grunn av de mange faktorene som kan påvirke utfallet av eksperimentet er det alltid tilrådelig at forsøket gjentas minst tre ganger og statistisk analyse utført. Denne analysen kan brukes eller sammenligne fartøy permeabilitet av mus som er blitt genetisk modifisert, samt mus med ulike genetiske bakgrunn. Permeabilitet kan vurderes i nærvær eller fravær av en stimulans, avhengig av funksjonen av genet som er modulert. Denne analysen kan også bli brukt, eller å teste effekten av forskjellige forbindelser på fartøyet permeabilitet.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENS </td></tr><tr><td> Evans Blue </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 0.2M Fosfat 1.5M NaCl pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> UTSTYR </td></tr><tr><td> Spektrofotometer </td><td> Eppendorf </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> MOUSE RESTRAINT DEVICE </td><td> HARVARD APPARAT </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> SPRØYTE </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> PINNE </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> Måle av nålen avhenger av størrelsen av dyret. </td></tr><tr><td> BALANSE </td><td> DENVER INSTRUMENT </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo assay to test blood vessel permeability

Denne metoden er basert på den intravenøse injeksjon av Evans Blue i mus som testen dyremodell. Evans blå er et fargestoff som binder albumin. Under fysiologiske betingelser endotelet er ugjennomtrengelig til albumin, så Evans Blue bundet albumin restene begrenset innenfor blodkar. I patologiske forhold som fremmer øket vaskulær permeabilitet endotelceller delvis miste sine nære kontakter og endotelet blir gjennomtrengelig for små proteiner som albumin. Denne tilstanden tillater ekstravasasjon av Evans Blue i vev. En sunn endothelium hindrer ekstravasering av fargestoffet i de nærliggende vaskularisert vev. Organer med økt permeabilitet vil vise betydelig blå farge i forhold til organer med intakt endotel. Nivået av vaskulær permeabilitet kan vurderes ved enkle visualisering eller ved kvantitativ måling av fargestoffet innlemmet per milligram vev av kontroll versus forsøksdyr / vev. To powerful aspekter ved denne analysen er dens enkelhet og kvantitative karakteristika. Evans Blue fargestoff kan utvinnes fra vev ved inkubering av en bestemt mengde vev i formamid. Evans Blue absorbans maksimum er på 620 nm og absorbans minimum er ved 740 nm. Ved å bruke en standard kurve for Evans Blue, kan optiske tetthetsmålinger bli omdannet til milligram fargestoff fanget per milligram av vev. Statistisk analyse bør brukes til å vurdere signifikante forskjeller i permeabilitet.

Vi brukte en in vivo permeabilitet analyse for å teste fartøyet lekkasje i mus 8-12 uker gamle. Denne testen er nyttig i å sammenligne den relative permeabilitet mellom dyr av forskjellig genetisk bakgrunn eller i en enkelt stamme av mus utsatt for behandlinger som påvirker vaskulatur. Våre resultater viser at en stamme av genmodifiserte mus vi opprettet i vårt laboratorium har en mer gjennomtrengelig endotel sammenlignet med vill-type mus. Disse endringene er tydelig ved makroskopisk nivå i man...

Watch this Scientific Journal Video about An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability at JoVE.com

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Vi presenterer en<em&gt; In vivo</em&gt; Analyse for å teste blodkar permeabilitet. Denne analysen er basert på intravenøs injeksjon av et fargestoff og påfølgende visualisering av diffusjon sin inn mellomrommene.

En<em&gt; In vivo</em&gt; Assay til Test Blood Vessel Permeabilitet

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Cytostatikaindusert Vaskulær Toxicity - Real-time<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Vessel Nedskrivning

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Tarm Sacs å vurdere slimhinner Permeabilitet i modeller av gastrointestinal sykdom

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

I Vitro- analyser for å vurdere blod-hjernebarriere Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

4-karet prøvetaking til integrative studier av human placental fysiologi<em&gt; In vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

En kronisk hjertesvikt Ischemia modell i svin bruker en Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Nytt Arterialized Rat delvis leveren transplantasjon med en i vivo fartøyet orienterte 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

En i Vivo metode for å vurdere Gut-Blood bommen og leveren metabolismen av bakterieflora produkter

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Måling av strial blodstrøm i mus cochlea utnytte et åpent fartøy-vindu og intravital fluorescens mikroskopi

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Presisjonskuttede lungeskiver som et effektivt verktøy for Ex vivo lungefartøystruktur og kontraktilitetsstudier

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...