Name: an in vivo assay to test blood vessel permeability
Uploaded: 2013-03-16T13:00:00
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Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde, R01CA142928.

1. Injecção intravenosa de azul de Evans na veia da cauda do rato Lateral <ol><li> Prepara-se uma solução de 0,5% de azul de Evans estéril em PBS. Se necessário, esterilizar por filtração da solução para remover qualquer matéria particulada que não se dissolveu. </li><li> Aspirar 200 ul solução azul de Evans para uma seringa. Evitar as bolhas de ar que possam ter escapado para a seringa. </li><li> Coloque ratos que são de 8-12 semanas de idade para um dispositivo de retenção de modo a que o animal nã...

<ol>
	<li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+NO+synthase:+role+in+cellular+signaling.">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li><li>Bertglia, S., Giusti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+capillary+perfusion+and+oxygen+delivery+regulation+during+systemic+hypoxia.">Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+reactions+to+histamine,+histamine-liberator+and+leutaxine+in+the+skin+of+guinea+pigs.">Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs.</a> J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).</li><li>Weis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+in+cardiovascular+disease+and+cancer.">Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer.</a> Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).</li><li>Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+endothelial+hyperpermeability:+implications+in+inflammation.">Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation.</a> Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).</li><li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+blood+pressure,+and+organ+damage+in+primary+hypertension.">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).</li><li>Scheppke, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2/Src+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits.">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).</li><li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CD34+Leads+To+Exacerbated+Autoimmune+Arthritis+through+Increased+Vascular+Permeability.">Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability.</a> J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).</li><li>Dvorak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-derived+mediators+of+enhanced+microvascular+permeability,+vascular+permeability+factor/vascular+endothelial+growth+factor,+histamine,+and+serotonin,+cause+leakage+of+macromolecules+through+a+new+endothelial+cell+permeability+organelle,+the+vesiculo-vacuolar+organelle.">Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle.</a> Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).</li><li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability.">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li><li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+"endothelium".">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li></ol>

Permeabilidade vascular é um marcador para o estado fundamental do vaso sanguíneo. Aumento da permeabilidade vascular tem mostrado estar presente em várias doenças sistémicas, incluindo a diabetes, a hipertensão, e doenças auto-imunes 6,7,8. Aumento da permeabilidade vascular tem sido mostrado para ser mediada por tensão de corte, os factores de crescimento tais como o factor de crescimento endotelial vascular e factor de crescimento de fibroblastos, os mediadores inflamatórios tais como histamina, s...

Formação e manutenção de barreiras permeáveis ​​selectivos são essenciais para o desenvolvimento do órgão apropriado e 1,2 desempenho. Linha de células endoteliais do lúmen do vaso sanguíneo e formar uma barreira semi-permeável, que é essencial para o transporte selectivo entre o sangue e o espaço intersticial de todos os órgãos. Uma barreira de permeabilidade adequada é mantida através apertados célula-a-célula junções que são estritamente controladas por factores de crescimento, citoquinas e moléculas de stress outros produtos 3. O rompimento da barreira de células endoteliais pode resultar em aumento da permeabilidade vascular e de fuga. Estes efeitos são observados em vários estados de doença e a compreensão da sinalização sublinhado molecular requer métodos multidisciplinares 4,5. Neste artigo, descreve um método in vivo para medir a permeabilidade vascular utilizando um modelo de rato. O ensaio que se descreve, também conhecido como ensaio de Miles, é uma bem establtada método para testar a permeabilidade vascular in vivo. O ensaio baseia-se no facto de que, sob condições fisiológicas basais, a albumina não atravessa a barreira endotelial. Azul de Evans, um corante azóico com elevada afinidade para a albumina, é injectado na corrente sanguínea de um animal experimental e, sob condições fisiológicas, é esperado para ser restringida dentro dos vasos sanguíneos. Quando um estímulo permeabilidade vascular é adicionado, quer por aplicação tópica ou sistemicamente, os vasos sanguíneos começar a vazar proteína e, assim, também o azul de Evans, que se liga à albumina. Isto resulta numa coloração rápida azulada dos tecidos que têm vasos permeáveis. Injecção com êxito do corante na veia da cauda do rato lateral é crítica para o bom resultado do experimento. Técnica de injecção da veia da cauda requer prática extensiva e deverá ser dominadas antes de se iniciar a experiência. Permeabilidade vascular é altamente dependente da idade e do peso do umImal, então quando comparando diferentes linhagens de camundongos, é imperativo que os ratos ou outros assuntos de teste têm perto de datas de nascimento e peso idênticos. Outros factores que influenciam a permeabilidade da barreira endotelial são condições ambientais, tais como temperatura, humidade, e muito importante, o stress manuseamento do rato. Devido ao grande número de fatores que podem influenciar o resultado do experimento, é sempre aconselhável que o experimento é repetido pelo menos três vezes e análise estatística realizada. Este ensaio pode ser utilizado para comparar a permeabilidade ou vaso de ratos que foram geneticamente modificadas, bem como os ratos com diferentes antecedentes genéticos. A permeabilidade pode ser determinada na presença ou na ausência de um estímulo, dependendo da função do gene, que é modulada. Este ensaio também pode ser usado ou para testar o efeito de diferentes compostos sobre a permeabilidade do vaso.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTES </td></tr><tr><td> Azul de Evans </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> FORMAMIDA </td><td> INVITROGEN </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Fosfato 0,2 M 1,5 M NaCl pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> ESPECTROFOTÔMETRO </td><td> EPPENDORF </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> Dispositivo de retenção MOUSE </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> SERINGA </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> AGULHAS </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> O calibre da agulha depende do tamanho do animal. </td></tr><tr><td> BALANÇO </td><td> Denver Instrument </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo assay to test blood vessel permeability

Este método baseia-se na injecção intravenosa de azul de Evans nos ratinhos como modelo animal de teste. Azul de Evans é um corante que se liga a albumina. Sob condições fisiológicas o endotélio é impermeável à albumina, de modo do azul de Evans encadernados restos de albumina restrito dentro dos vasos sanguíneos. Em condições patológicas que promovem o aumento da permeabilidade vascular células endoteliais parcialmente perder seus contatos próximos e com o endotélio torna-se permeável a pequenas proteínas, como a albumina. Esta condição permite o extravasamento de azul de Evans dos tecidos. Um endotélio saudável impede o extravasamento do corante nos tecidos vizinhos vascularizados. Órgãos com aumento da permeabilidade irá mostrar um aumento significativo em comparação com coloração azul órgãos com endotélio intacto. O nível de permeabilidade vascular pode ser avaliado por simples visualização ou por medição quantitativa do corante incorporado por miligrama de tecido de controlo versus animal experimental / tecido. Dois powerful aspectos deste ensaio são a simplicidade e características quantitativas. O Evans Blue, podem ser extraídos a partir de tecidos por incubação de uma quantidade específica de tecido em formamida. Evans Blue é a absorvância máxima a 620 nm e a absorvência é mínima a 740 nm. Utilizando uma curva padrão para o azul de Evans, medições da densidade óptica pode ser convertida em miligrama de corante capturado por miligrama de tecido. A análise estatística deve ser usado para avaliar diferenças significativas na permeabilidade vascular.

Foi utilizado um ensaio in vivo para testar a permeabilidade vazamento navio em ratinhos de 8-12 semanas de idade. Este teste é útil para comparar a permeabilidade vascular relativa entre animais de fundo genético diferente ou em uma única estirpe de ratos submetidos a tratamentos que afectam a vasculatura. Os nossos resultados mostram que a estirpe de murganhos geneticamente modificados, criados no nosso laboratório tem um endotélio mais permeável em comparação com ratinhos de tipo selvagem. ...

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An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Estamos apresentando um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para testar a permeabilidade dos vasos sanguíneos. Este ensaio baseia-se na injecção intravenosa de uma visualização do corante e subsequente da sua difusão para os espaços intersticiais.

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Research

JoVE Journal

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