Name: visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells
Uploaded: 2012-12-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells at JoVE.com

यह काम XAC और एएफपी के लिए राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

1. निकासी के लिए सामग्री तैयार <ol><li> कक्षों की तैयारी <ol><li> कम से कम एक दिन के लिए बीज के ऊतकों एसिड इलाज coverslips पर संस्कृति कोशिकाओं को प्रयोग करने के लिए पहले. हम COS-7 या U2OS का उपयोग करते हैं, के रूप में इन दो सेल ला?...

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	<li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+(SRP)+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li><li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+(SRP)+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li><li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation.">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li><li>Grlich, D., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+translocation+into+proteoliposomes+reconstituted+from+purified+components+of+the+endoplasmic+reticulum+membrane.">Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane.</a> Cell. 75, 615-630 (1993).</li><li>Milcarek, C., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+polyribosomes+in+HeLa+cells:+association+of+polyadenylic+acid+with+membranes.">Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes.</a> J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).</li><li>Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+with+microsomal+membranes+in+human+diploid+fibroblasts.">Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts.</a> J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).</li><li>Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+labeled+in+the+presence+of+fluoroorotate+with+membranes+of+the+endoplasmic+reticulum+in+rat+liver.">Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver.</a> J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).</li><li>Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+mRNA+on+the+endoplasmic+reticulum+membranes+after+in+vivo+disassembly+of+polysomes+by+an+inhibitor+of+initiation.">Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation.</a> J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).</li><li>Kruppa, J., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+poly+A(+)+messenger+RNA+from+rat+liver+rough+microsomes+upon+disassembly+of+bound+polysomes.">Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes.</a> J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).</li><li>Adesnik, M., Maschio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+specific+classes+of+messenger+RNA+into+free+and+membrane-bound+polysomes.">Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes.</a> Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).</li><li>Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p180+Promotes+the+Ribosome-Independent+Localization+of+a+Subset+of+mRNA+to+the+Endoplasmic+Reticulum.">p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum.</a> PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).</li><li>Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+ribosome+functions.">Inhibitors of ribosome functions.</a> Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).</li><li>Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+in+eukaryotic+systems+by+harringtonine.">Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine.</a> Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).</li><li>Weeks, D. P., Baxter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+peptide-chain+initiation+by+2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.">Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.</a> Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147, 789-802 (2011).</li><li>Lerner, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+and+translation+of+mRNAs+encoding+soluble+proteins+on+membrane-bound+ribosomes.">Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes.</a> RNA. 9, 1123-1137 (2003).</li><li>Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+protein+import+in+permeabilized+mammalian+cells+requires+soluble+cytoplasmic+factors.">Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors.</a> J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Lcuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+implications+of+mRNA+localization+pathways+in+cellular+organization.">Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).</li><li>Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mRNA+nuclear+export+kinetics+in+mammalian+cells+by+microinjection.">Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection.</a> J Vis Exp. 46, e2387 (2010).</li></ol>

mRNAs की विभिन्न subcellular साइटों के लिए स्थानीयकरण, mRNA स्थानीयकरण प्रोटीन के साथ टेप की बातचीत के माध्यम से, अपने अंतिम गंतव्य के लिए प्रोटीन की उचित छँटाई के लिए, और जीन अभिव्यक्ति की ठीक ट्यूनिंग के लिए एक व्य?...

Eukaryotes में, mRNA एन्कोडिंग secreted और झिल्ली प्रोटीन संकेत मान्यता कण 1,2 सह translationally ईआर लक्षित किया जा सकता है और 3,4 अनुवाद के दौरान ribosomes और translocons के बीच प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से ईआर पर बनाए रखा जा सकता है. बहरहाल, चाहे mRNAs और लक्षित किया जा सकता है या तो ribosomes या अनुवाद की ईआर स्वतंत्र पर बनाए रखा बहुत हाल ही में जब तक स्पष्ट नहीं था. पिछले अध्ययनों से पता करने का प्रयास करने के लिए पता है कि वहाँ अनुवाद स्वतंत्र ईआर सेलुलर fractionation तकनीक का उपयोग करने के साथ mRNA संघ है. क्योंकि रासायनिक कठोर शर्तों ईआर प्राप्त vesicles, है जो संभावित नाजुक mRNA ईआर संघ को बाधित हो सकता है से राइबोसोम को अलग करने के लिए आवश्यक थे, इन अध्ययनों अनिर्णायक थे, 5-8 के लिए साक्ष्य उपलब्ध कराने और 9,10 के खिलाफ ribosomal स्वतंत्र mRNA की ईआर प्रस्तोता . इन समस्याओं को दरकिनार करने के लिए हम एक आद्य विकसित किया हैकर्नल को अलग करने के लिए और ईआर mRNAs बाध्य छवि. इस प्रक्रिया में एक हल्के निष्कर्षण इलाज है, जो प्रभावी रूप से सेल (गैर ईआर ही mRNAs सहित) के सभी cytoplasmic सामग्री को हटा जबकि एक साथ ईआर morphology और उसके जुड़े अणुओं के सभी के संरक्षण शामिल है. हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर दिखा दिया है कि mRNAs की एक सबसेट लक्षित कर रहे हैं और फिर स्वतंत्र रूप से ribosomes या अनुवाद 11 ईआर पर बनाए रखा.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

Eukaryotes में, दूत (mRNAs) RNAs कि secreted और झिल्ली प्रोटीन endoplasmic जालिका (ईआर) की सतह स्थानीयकृत हैं सांकेतिक शब्दों में बदलना के अधिकांश. हालांकि, इन mRNAs के दृश्य चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यह विशेष रूप से सच है जब mRNA की केवल एक अंश ईआर से जुड़े है और उनके इस organelle से वितरण गैर लक्षित टेप (यानी &quot;मुक्त&quot;) द्वारा बाधित है. आदेश में ईआर जुड़े mRNAs पर नजर रखने के लिए, हम एक विधि है जो कोशिकाओं में एक digitonin निष्कर्षण समाधान है कि चुनिंदा प्लाज्मा झिल्ली permeabilizes एक कम जोखिम के साथ व्यवहार कर रहे हैं विकसित किया है, और इस प्रकार cytoplasmic सामग्री को हटा है, जबकि एक साथ ईआर की अखंडता को बनाए रखने . जब इस विधि स्वस्थानी संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट के साथ मिलकर किया है, एक स्पष्ट रूप से फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा ईआर बाध्य mRNAs कल्पना कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग या तो थोक पाली (A) टेप या विशिष्ट mRNAs ईआर एसोसिएशन की डिग्री मूल्यांकन किया जा सकता हैऔर भी मात्रा. इस प्रक्रिया में एक इस परख का उपयोग के mRNA ईआर बातचीत की प्रकृति की जांच कर सकते हैं.

MRNA का प्रतिशत कि ईआर जुड़े है क्योंकि 7-कोशिकाओं कि plasmids है कि अपरा alkaline फॉस्फेट (ALPP) या साइटोक्रोम P450 8B1 (CYP8B1) या तो digitonin साथ निकाले गए थे और फिर तय है, या सीधे तय निहित साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे निर्धारित (1 चित्...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

यहाँ हम एक स्तनधारी टिशू कल्चर कोशिकाओं में endoplasmic जालिका जुड़े mRNAs कल्पना विधि का वर्णन है. यह तकनीक digitonin के साथ प्लाज्मा झिल्ली की चयनात्मक permeabilization शामिल cytoplasmic फ्लोरोसेंट द्वारा पीछा सामग्री हटाने<em&gt; स्वस्थानी में</em&gt; के लिए या तो थोक पाली (ए) mRNA या विशिष्ट टेप का पता लगाने के संकरण.

स्तनधारी कोशिकाओं में endoplasmic जालिका स्थानीयकृत mRNAs का विज़ुअलाइज़ेशन

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing और स्तनधारी कोशिकाओं Subculturing

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

पक्षपाती और गैर पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं की स्वस्थानी Subcellular Fractionation

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

आरएनएआई स्क्रीनिंग के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में मिशन esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

MRNA परमाणु निर्यात कैनेटीक्स के Microinjection द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

सेल चक्र स्थिति के स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

सभ्य कोशिकाओं में जालिका उप के दृश्य

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

स्थानीयकृत अनुवाद के तंत्र का अध्ययन करने के लिए खमीर Mitochondria साथ mRNAs एसोसिएटेड का अलगाव

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में हीम संश्लेषण स्तर की माप

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में व्यापक समानांतर रिपोर्टर Assays

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

इमेजिंग स्थानीय सीए<sup&gt; 2 +</sup&gt; संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में सिग्नल

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...