Name: visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells
Uploaded: 2012-12-17T15:00:00
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이 작품은 XAC와 AFP에 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다

1. 추출을위한 자료의 작성 <ol><li> 셀의 준비 <ol><li> 실험하기 전에 최소한 하나의 일에 대한 산 처리 coverslips에 씨 조직 문화 세포. 이 두 세포 라인이 분비 단백질의 강력한 생산을 전시하고 잘 정의 된 ER을 가지고 우리는 COS-7 또는 U2OS을 사용합니다. 높은 추출 효율을 달성하기 위해, 세포 실험 당일 coverslip에 confluency 80 %를 초과 할 수 없습니다합니다. </li><li> 특정 외인성 mRNA가 조사하는 경우, ?...

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	<li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+(SRP)+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li><li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+(SRP)+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li><li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation.">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li><li>Grlich, D., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+translocation+into+proteoliposomes+reconstituted+from+purified+components+of+the+endoplasmic+reticulum+membrane.">Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane.</a> Cell. 75, 615-630 (1993).</li><li>Milcarek, C., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+polyribosomes+in+HeLa+cells:+association+of+polyadenylic+acid+with+membranes.">Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes.</a> J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).</li><li>Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+with+microsomal+membranes+in+human+diploid+fibroblasts.">Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts.</a> J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).</li><li>Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+labeled+in+the+presence+of+fluoroorotate+with+membranes+of+the+endoplasmic+reticulum+in+rat+liver.">Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver.</a> J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).</li><li>Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+mRNA+on+the+endoplasmic+reticulum+membranes+after+in+vivo+disassembly+of+polysomes+by+an+inhibitor+of+initiation.">Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation.</a> J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).</li><li>Kruppa, J., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+poly+A(+)+messenger+RNA+from+rat+liver+rough+microsomes+upon+disassembly+of+bound+polysomes.">Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes.</a> J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).</li><li>Adesnik, M., Maschio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+specific+classes+of+messenger+RNA+into+free+and+membrane-bound+polysomes.">Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes.</a> Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).</li><li>Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p180+Promotes+the+Ribosome-Independent+Localization+of+a+Subset+of+mRNA+to+the+Endoplasmic+Reticulum.">p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum.</a> PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).</li><li>Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+ribosome+functions.">Inhibitors of ribosome functions.</a> Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).</li><li>Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+in+eukaryotic+systems+by+harringtonine.">Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine.</a> Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).</li><li>Weeks, D. P., Baxter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+peptide-chain+initiation+by+2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.">Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.</a> Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147, 789-802 (2011).</li><li>Lerner, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+and+translation+of+mRNAs+encoding+soluble+proteins+on+membrane-bound+ribosomes.">Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes.</a> RNA. 9, 1123-1137 (2003).</li><li>Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+protein+import+in+permeabilized+mammalian+cells+requires+soluble+cytoplasmic+factors.">Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors.</a> J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Lcuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+implications+of+mRNA+localization+pathways+in+cellular+organization.">Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).</li><li>Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mRNA+nuclear+export+kinetics+in+mammalian+cells+by+microinjection.">Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection.</a> J Vis Exp. 46, e2387 (2010).</li></ol>

다양한 subcellular 사이트에 mRNAs의 현지화는 mRNA의 현지화 단백질과 성적의 상호 작용을 통해 subcellular의 로컬 요구 사항에 대한 그들의 최종 목적지 단백질의 적절한 정렬을위한, 그리고 유전자 표현의 미세 조정에 중요한 널리 현상입니다 지역 19,20. 검정을 사용하면 여기에 설명 된, 우리는 분비 단백질을 인코딩 mRNAs는 리보솜 또는 번역의 유무에 ER에서 유지 될 수 ?...

eukaryotes에서 mRNA 인코딩 번역 3,4 동안 리보솜과 translocons 사이의 직접 상호 작용을 통해 분비와 막 단백질은 공동 translationally 신호 인식 입자 1,2에 의해 응급실로 타겟팅 할 수 있으며, ER에서 유지 관리 할 수 있습니다. 그러나, mRNAs가 타겟팅하고 리보솜 또는 번역 중의 ER 독립을 유지 할 수 있는지 여부 것은 매우 최근까지 불분명했다. 이전 연구는 세포 분획 기법을 사용하여 ER로 번역 독립적 인 mRNA 협회가 있는지 해결하기 위해 시도했습니다. 거친 화학 조건이 잠재적으로 민감한 mRNA-ER 협회가 바뀐다 ER 파생 소포에서 리보솜을 해제해야 되었기 때문에,이 연구는 5-8에 대한 증거를 제공하고, 결정적이었고 9,10에 대한 ribosomal 독립적 인 mRNA의 응급실로 고정 . 이러한 문제를 회피하기 위해 우리는 proto을 개발했습니다콜 분리 및 이미지 ER-바운드 mRNAs를합니다. 이 절차를 동시에 ER 형태와 관련 분자의 모든을 유지하면서 효과적으로 세포 (비 ER-바운드 mRNAs 포함)의 모든 세포질 내용을 제거 가벼운 추출 치료를하는 것입니다. 이 프로토콜 사용 우리는 mRNAs의 일부 타겟팅하고 독립적으로 리보솜 또는 번역 (11)의 ER에 유지하는 증명하고있다.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

eukaryotes에서 분비와 막 단백질이 소포체 endoplasmic (ER)의 표면에 지역화 아르 인코딩 메신저 RNAs (mRNAs)의 대부분. 그러나 이러한 mRNAs의 시각화가 도전 할 수 있습니다. 이것은 mRNA의 일부만이 ER-관련 될 때 특히 사실이다이 세포 기관과의 배포가 아닌 타겟 (예 : &quot;무료&quot;) 성적 증명서에 의해 가려합니다. 동시에 ER의 무결성을 유지하면서 ER-관련 mRNAs을 모니터링하기 위해, 우리는 세포가 선택적으로 플라즈마 멤브레인을 permeabilizes digitonin 추출 솔루션에 대한 짧은 노출로 치료되는 방법을 개발하고, 따라서 세포질 내용을 제거했습니다 . 이 방법은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광와 결합 될 때, 하나는 분명 형광 현미경으로 ER-바운드 mRNAs를 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 대량 폴리 (A) 성적 증명서 또는 특정 mRNAs 중 하나에 ER-협회의 정도를 평가 할 수 있습니다심지어 정량. 이 과정에서, 하나는 mRNA-ER 상호 작용의 특성을 조사하기 위해이 분석을 사용할 수 있습니다.

ER-연결되어있는 mRNA의 비율, 태반 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (ALPP) 또는 시토크롬 P450-8B1이 (CYP8B1) 또는 digitonin로 추출 후 수정, 또는 직접 수정되었습니다를 포함 plasmids와 transfected 된 COS-7 세포를 확인하려면 (그림 1 참조, 비교 &quot;Ctrl 키를 추출&quot;을 &quot;Ctrl 키를 Unextracted&quot;). 비 핵 형광은 샘플 및 ER-관련 mRNA의 분율은 (그림 2) 계산에 모두 정량화되...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

여기 포유류의 조직 배양 세포에서 endoplasmic 소포체 - 관련 mRNAs을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 형광등에 이어 세포질 내용을 제거 할 digitonin과 플라즈마 막의 선택적 permeabilization을 포함<em&gt; 현장에서</em어느 대량 폴리 (A) mRNA 또는 특정 기록을 검색 할 수&gt; 하이브리드.

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

포유 동물 세포를 Trypsinizing 및 Subculturing

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

연구

생물학

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 Subcellular 분별 (분리)에서

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...