Name: visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells
Uploaded: 2012-12-17T15:00:00
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Este trabalho foi financiado por doações do Nacional de Ciência e Pesquisa de Engenharia Council of Canada para XAC e AFP

1. Preparação de Materiais para extracção <ol><li> Preparação de Células <ol><li> Semente células de cultura de tecidos tratados com ácido sobre lamelas durante pelo menos um dia antes da experiência. Usamos COS-7 ou U2OS, como estas duas linhas de células exibem robusta de produção de proteína segregada e tem um ER bem definida. Note-se que para obter a eficiência de extracção elevado, as células não deve exceder 80% de confluência no lamela no dia da experiência. </li><li> Se um mRNA específico...

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	<li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+(SRP)+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li><li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+(SRP)+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li><li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation.">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li><li>Grlich, D., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+translocation+into+proteoliposomes+reconstituted+from+purified+components+of+the+endoplasmic+reticulum+membrane.">Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane.</a> Cell. 75, 615-630 (1993).</li><li>Milcarek, C., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+polyribosomes+in+HeLa+cells:+association+of+polyadenylic+acid+with+membranes.">Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes.</a> J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).</li><li>Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+with+microsomal+membranes+in+human+diploid+fibroblasts.">Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts.</a> J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).</li><li>Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+labeled+in+the+presence+of+fluoroorotate+with+membranes+of+the+endoplasmic+reticulum+in+rat+liver.">Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver.</a> J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).</li><li>Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+mRNA+on+the+endoplasmic+reticulum+membranes+after+in+vivo+disassembly+of+polysomes+by+an+inhibitor+of+initiation.">Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation.</a> J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).</li><li>Kruppa, J., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+poly+A(+)+messenger+RNA+from+rat+liver+rough+microsomes+upon+disassembly+of+bound+polysomes.">Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes.</a> J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).</li><li>Adesnik, M., Maschio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+specific+classes+of+messenger+RNA+into+free+and+membrane-bound+polysomes.">Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes.</a> Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).</li><li>Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p180+Promotes+the+Ribosome-Independent+Localization+of+a+Subset+of+mRNA+to+the+Endoplasmic+Reticulum.">p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum.</a> PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).</li><li>Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+ribosome+functions.">Inhibitors of ribosome functions.</a> Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).</li><li>Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+in+eukaryotic+systems+by+harringtonine.">Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine.</a> Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).</li><li>Weeks, D. P., Baxter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+peptide-chain+initiation+by+2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.">Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.</a> Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147, 789-802 (2011).</li><li>Lerner, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+and+translation+of+mRNAs+encoding+soluble+proteins+on+membrane-bound+ribosomes.">Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes.</a> RNA. 9, 1123-1137 (2003).</li><li>Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+protein+import+in+permeabilized+mammalian+cells+requires+soluble+cytoplasmic+factors.">Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors.</a> J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Lcuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+implications+of+mRNA+localization+pathways+in+cellular+organization.">Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).</li><li>Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mRNA+nuclear+export+kinetics+in+mammalian+cells+by+microinjection.">Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection.</a> J Vis Exp. 46, e2387 (2010).</li></ol>

A localização dos mRNAs para vários locais subcelulares, através da interacção com proteínas de transcritos de mRNA de localização, é um fenómeno generalizado importante para a triagem adequada de proteínas para o seu destino final, e para o ajuste fino da expressão de genes com os requisitos locais de uma subcelular região 19,20. Utilizando o ensaio aqui descrito, revisitamos a questão de se os ARNm que codificam para proteínas de secreção pode ser mantida no ER...

Nos eucariotas, a codificação de mRNA e proteínas da membrana secretada pode ser orientada para o ER por co-tradução do sinal de reconhecimento 1,2 partícula e pode ser mantido no ER via das interacções directas entre os ribossomas e translocons durante a tradução 3,4. No entanto, se mRNAs podem ser direcionados e mantido na ER independente de ou ribossomos ou a tradução não estava claro até muito recentemente. Estudos anteriores tentaram abordar se há tradução independente de associação com o mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamento celular. Como as condições químicas severas eram necessárias para desassociar ribossomos de ER vesículas derivados, que podem interromper o potencialmente delicado mRNA-ER associação, esses estudos não foram conclusivos, fornecendo provas para 5-8 e contra 9,10 ribossomal independente de ancoragem de mRNA para o pronto-socorro . Para contornar estes problemas, desenvolvemos um protocol para isolar e imagem ER ligados mRNAs. Este procedimento envolve um tratamento de extracção suave, que remove eficazmente todo o conteúdo citoplasmático da célula (incluindo os não-ligado ER mRNAs), ao mesmo tempo preservando a morfologia ER e todas as suas moléculas associadas. Usando este protocolo, demonstramos que um subconjunto de mRNAs são orientados e, em seguida, mantido na ER independentemente de ribossomas ou de tradução 11.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

Nos eucariotas, a maioria dos RNAs mensageiros (mRNAs), que codificam proteínas de membrana e segregadas são localizados na superfície do retículo endoplasmático (ER). No entanto, a visualização destes mRNAs pode ser um desafio. Isto é especialmente verdadeiro quando apenas uma fracção do mRNA é ER-associado e a sua distribuição a esta organela é obstruída por não-segmentados (isto é, &quot;livre&quot;) transcrições. A fim de controlar ER-associados mRNAs, foi desenvolvido um método no qual as células são tratadas com uma exposição de curta duração a uma solução de extracção que digitonina permeabilizes selectivamente a membrana do plasma e, portanto, remove o conteúdo citoplasmático, mantendo simultaneamente a integridade do ER . Quando este método é acoplado com hibridação in situ fluorescente (FISH), pode-se visualizar claramente ER-bound mRNAs por microscopia de fluorescência. Usando este protocolo o grau de ER-associação, quer para a granel de poli (A) ou transcritos de ARNm específicos podem ser avaliadose ainda quantificado. No processo, pode-se utilizar este teste para investigar a natureza do mRNA do ER-interacções.

Para determinar a percentagem de mRNA que é ER-associado, células COS-7 que foram transfectadas com os plasmídeos que continham a fosfatase alcalina de placenta (ALPP) ou citocromo P450-8b1 (CYP8B1) ou foram extraídas com digitonina e, em seguida, fixo, ou fixo directamente (ver Figura 1, comparar &quot;não extraído Ctrl&quot; para &quot;Extraído Ctrl&quot;). A fluorescência não nuclear foi quantificada em ambas as amostras e a fracção de ER-associated mRNA foi calculado <st...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Descrevemos aqui um método para visualizar retículo endoplasmático associadas mRNAs em células de cultura de mamífero de tecidos. Esta técnica envolve a permeabilização selectiva da membrana plasmática com digitonina para remover conteúdo citoplasmático seguido fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação para detectar ou poli granel (A) mRNA ou transcritos específicos.

Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biologia

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...