Name: visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells
Uploaded: 2012-12-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells at JoVE.com

Bu çalışma XAC ve AFP Ulusal Bilim ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi bağışları ile desteklenmiştir

1. Ekstraksiyon için Materyallerinin Hazırlanması <ol><li> Hücre Hazırlanması <ol><li> Deney öncesinde en az bir gün için asit ile tedavi edilen lameller üzerine Tohum doku kültürü hücreleri. Bu iki hücre hatları salgılanan protein güçlü üretim sergilemek ve iyi tanımlanmış bir ER sahip olarak biz, COS-7 veya U2OS kullanın. Yüksek ekstraksiyon verimi elde etmek için, hücrelerin deney gününde lamel confluency% 80 geçmemesi gerektiğini unutmayın. </li><li> Belirli bir eksojen mRNA araşt...

<ol>
	<li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+(SRP)+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li><li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+(SRP)+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li><li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation.">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li><li>Grlich, D., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+translocation+into+proteoliposomes+reconstituted+from+purified+components+of+the+endoplasmic+reticulum+membrane.">Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane.</a> Cell. 75, 615-630 (1993).</li><li>Milcarek, C., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+polyribosomes+in+HeLa+cells:+association+of+polyadenylic+acid+with+membranes.">Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes.</a> J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).</li><li>Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+with+microsomal+membranes+in+human+diploid+fibroblasts.">Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts.</a> J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).</li><li>Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+labeled+in+the+presence+of+fluoroorotate+with+membranes+of+the+endoplasmic+reticulum+in+rat+liver.">Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver.</a> J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).</li><li>Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+mRNA+on+the+endoplasmic+reticulum+membranes+after+in+vivo+disassembly+of+polysomes+by+an+inhibitor+of+initiation.">Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation.</a> J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).</li><li>Kruppa, J., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+poly+A(+)+messenger+RNA+from+rat+liver+rough+microsomes+upon+disassembly+of+bound+polysomes.">Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes.</a> J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).</li><li>Adesnik, M., Maschio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+specific+classes+of+messenger+RNA+into+free+and+membrane-bound+polysomes.">Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes.</a> Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).</li><li>Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p180+Promotes+the+Ribosome-Independent+Localization+of+a+Subset+of+mRNA+to+the+Endoplasmic+Reticulum.">p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum.</a> PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).</li><li>Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+ribosome+functions.">Inhibitors of ribosome functions.</a> Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).</li><li>Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+in+eukaryotic+systems+by+harringtonine.">Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine.</a> Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).</li><li>Weeks, D. P., Baxter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+peptide-chain+initiation+by+2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.">Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.</a> Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147, 789-802 (2011).</li><li>Lerner, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+and+translation+of+mRNAs+encoding+soluble+proteins+on+membrane-bound+ribosomes.">Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes.</a> RNA. 9, 1123-1137 (2003).</li><li>Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+protein+import+in+permeabilized+mammalian+cells+requires+soluble+cytoplasmic+factors.">Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors.</a> J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Lcuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+implications+of+mRNA+localization+pathways+in+cellular+organization.">Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).</li><li>Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mRNA+nuclear+export+kinetics+in+mammalian+cells+by+microinjection.">Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection.</a> J Vis Exp. 46, e2387 (2010).</li></ol>

Çeşitli Subselüler sitelere mRNA&#39;ların lokalizasyonu, mRNA localisation proteinler ile transkript etkileşimi aracılığıyla, bir hücre içi ve yerel gereksinimler nihai hedefe proteinlerin doğru sıralama için ve gen ekspresyonu ince ayar için önemli bir yaygın bir olgudur bölge 19,20. Tahlil kullanılarak burada açıklandığı gibi, bu salgı proteinleri kodlayan mRNA ribozom ya da çeviri varlığında veya yokluğunda, ER muhafaza edilebilir olup olmadığı...

Ökaryotlarda mRNA kodlama çeviri 3,4 sırasında ribozomlar ve translocons arasındaki doğrudan etkileşim yoluyla salgılanan ve membran proteinlerinin eş Çevrimsel sinyal tanıma parçacık 1,2 ER hedeflenebilir ve ER korunabilir. Ancak, mRNA hedefli ve ribozomlar veya çeviri birinin ER bağımsız üzerinde muhafaza edilip edilemeyeceğini çok yakın zamanlara kadar belli değildi. Önceki çalışmalar hücresel fraksiyonlama teknikleri kullanılarak ER ile çeviri bağımsız mRNA ilişki olup olmadığını değinmeye çalıştık. Sert kimyasal koşulların potansiyel hassas mRNA-ER dernek kesebileceği ER türetilmiş veziküller, ribozomların kesmek için gerekli olduğu için, bu çalışmalarda 5-8 delil sağlayan, sonuçsuz ve 9,10 karşı ribozomal bağımsız mRNA ER ankraj . Bu sorunları aşmak için bir proto geliştirdikcol yalıtmak ve görüntü ER bağlı mRNA&#39;ların için. Bu prosedür, aynı anda ER morfoloji ve ilişkili moleküllerin tüm koruyarak etkin bir şekilde hücre (ER-bağlı olmayan mRNA dahil), tüm içerik sitoplazmik kaldıran bir hafif çıkarma tedavi, içerir. Bu protokolü kullanarak biz mRNA&#39;ların bir alt hedef ve sonra bağımsız ribozomlar veya çeviri 11 ER muhafaza olduğunu göstermiştir.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

Ökaryotlarda salgılanan ve membran proteinleri endoplazmik retikulum (ER) yüzeyine lokalizedir kodlamak haberci RNA&#39;lar (mRNA) çoğu. Bununla birlikte, bu mRNA&#39;ların görselleştirme zor olabilir. Bu mRNA yalnızca bir kısmını ER ilişkili olduğunda özellikle doğrudur ve bu organel kendi dağıtım olmayan hedefli (yani &quot;özgür&quot;) transkript tarafından engelleniyor. Aynı anda ER bütünlüğünü korurken ER-ilişkili mRNA izlemek için, biz, hücreler seçici olarak plazma zarının bir permeabilizes digitonin ekstraksiyon çözeltisi için kısa bir maruz kalma ile muamele edildiği bir yöntem geliştirilmiştir ve bu nedenle sitoplazmik içeriğini kaldırır adres . Bu yöntem in situ hibridizasyon (FISH) flüoresan ile birleştiğinde, biri açıkça floresan mikroskobu ile ER-bound mRNA&#39;ların oluşturulabiliyor. Bu protokol kullanılarak yığın poli (A) ya da spesifik mRNA transkriptleri için ya da ER-bağlantının derecesini tespit edilebilirve hatta sayılabilir. Bu süreç içinde bir mRNA ER etkileşimlerinin doğası araştırmak için bu testte kullanılabilir.

ER-ilişkili olan mRNA yüzdesi, plasental alkalin fosfataz (ALPP) ya da sitokrom P450-8B1 (CYP8B1) ya da digitonin ile ekstre edilmiş ve daha sonra çözülmüştür, ya da direkt olarak tespit edildi içeren plazmitler ile birlikte transfekte edilmiş COS-7 hücreleri belirlemek için (bkz. Şekil 1, karşılaştırın &quot;Ctrl Çıkarılan&quot; için &quot;Ctrl Unextracted&quot;). Nükleer olmayan floresan örnekleri ve ER-ilişkili mRNA fraksiyonu (Şekil 2) he...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells at JoVE.com

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA&#39;ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici içerir<em&gt; In situ</emYa da yığın poli (A) ya da spesifik mRNA transkriptleri tespit etmek için&gt; melezleme.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...