Name: c. elegans chemotaxis assay
Uploaded: 2013-04-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about C. elegans Chemotaxis Assay at JoVE.com

Vi takker Biovidenskab og fakultetets for Kunst og Videnskab ved Dronningens University for at finansiere dette arbejde. Samt, tak vi Chin-Sang laboratorium for at levere de nødvendige reagenser, udstyr og teknisk support. Vi takker også QGEM 2011, især Tony han for hans bidrag til diskussionen.

1.. Klargøring / vask Worms <ol><li> Synkroniser orme til unge voksne 11. </li><li> Afpipetteres 2 ml af S Basal på en 5 cm Chemotaxis plade af iscenesatte orme, der netop har ryddet plænen OP50 E. coli. Vip pladen efter behov for at sikre, at orme er vasket fra pladens overflade i bufferen. </li><li> 1 ml af ormen-S Basal opløsning i et mikrocentrifugerør. </li><li> Centrifuger i 10 sekunder ved hjælp af en PicoFuge på 6.600 rpm. </li><li> Aspirer S Basal, forlader pelleten af ​​orme uf...

<ol>
	<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li><li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+preference+in+C.+elegans.">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+chemotaxis+responses:+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans.">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis.">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods:+Synchronization+and+Observation.">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (1895).</li></ol>

Kemotaxi, selvom styres af et komplekst sæt af neuronale og cellulære mekanismer, kan være let og objektivt kvantificeres ved hjælp af kemotaxi assays. For at opnå de bedste resultater fra de analyser, skal visse kritiske trin skal træffes. For det første iscenesættelse ormene er afgørende i giver ensartede eksperimentelle resultater. Worms på forskellige livsstadier opfører sig anderledes 13, så blandede fase orme kan skew eksperimentelle resultater. For det andet sikrer alle E. coli vas...

Ward først udviklet kemotaksi assay i 1973 5, og siden da har haft vidtrækkende applikationer. Neurobiologi er et felt, der har gavn af anvendelse af en række kemotaxi assays. Olfaktoriske tilpasning, en simpel form for indlæring og hukommelse, er blevet påvist i C. elegans bruger chemotaxis assays 6. De er også blevet anvendt til at vise, at C. elegans kan udvikle ethanol tolerance-et resultat, der ikke kun viser adfærdsmæssige plasticitet af ormene, men som også viser, at ormene kan være meget nyttige i studiet af alkoholafhængighed hos mennesker 3. Assays er endda blevet udviklet til at demonstrere evnen af C. elegans til at gemme kort og lang sigt hukommelse ved at vise, at foreninger er lavet af ormene mellem kemoattraktanter og fødevarer (OP50) 7.. Derudover får de omfattende foreliggende oplysninger vedrørende C. elegans genomet, den chemotaxis adfærd C. elegans er blevet ændret talrige gange ved at inducere mutationer 1,8. Dette giver mulighed for mange spændende tekniske muligheder, såsom udvikling af C. elegans som en bioremediering værktøj. Således, siden den første udvikling af kemotaksi-assay i 1973, er det blevet hyppigt ændret og anvendt til at belyse mysterier i en række forskellige discipliner. Visse assays til formål at opdage den specifikke rute, som ormene mod et mål. Den prototypiske assay af denne type blev udviklet af Ward 5.. Tre orme blev placeret på smeltet agar til 15 min. Deres bevægelser blev sporet af aftrykket de efterlades som de rejste fra periferien af ​​pladen op en gradient til et tiltrækkende på midten af ​​pladen. Alle orme på pladen blev anholdt under anvendelse af chloroform ved slutningen af ​​hvert forsøg. En efterkommer af denne metode placeres en enkelt orm i midten af ​​pladen med lokkemidler og kontrol ent lige og modsat afstande fra oprindelsen 2. Gennembore-Shimomura et al. udviklet en assay til at observere den nøjagtige karakter af bevægelsen er involveret i chemotaxis 9.. Individuelle orme blev anbragt i 9 cm petriskåle enten indeholder en ensartet koncentration af lokkemidler eller en radialt formet forløb, der kulminerede i kilden lokkemidler. En computer software program, der anerkendes ormen blev anvendt til at optage den observerede adfærd. Et videokamera fastgjort til et mikroskop sammen med denne fase for at justere petriskålen automatisk assayet løb at sikre ormen forblev i synsfeltet. Fra dette blev mere detaljerede oplysninger opdaget vedrørende årsagen til pirouetter vises ved C. elegans. Andre analyser, mere ligner den her beskrevne, testede respons af en stor population af orme til testforbindelser. To kvadrant kemotaxi assays har væretbruges til at udforske de roller, de forskellige neuroner, receptorer, og signaltransduktionsmolekyler afspilles, når C. elegans blev udsat for forskellige forbindelser 1.. Mellem 20-50 vaskede orme blev placeret nær centrum af pladen med et tiltrækkende og en kontrol på polære ender sammen med bedøvelsesmiddel, natriumazid (NaN3). Efter 60 min blev en chemotaktisk indeks med værdier fra -1.0 til +1.0 genereret på baggrund af forskellen mellem, hvor mange orme blev anbragt på lokkemidler eller kontrollen. En lignende chemotaktisk indeks blev anvendt i analysen rapporteret i denne artikel, selvom den tidligere assay undladt at strengt evaluere nonmotile orme. Dette assay blev derefter yderligere anvendt til at teste virkningerne af neuronal ablation på kemotaxi. En anden variation af den ovennævnte assay blev udført, hvor 100-200 orme blev placeret i centrum af en plade indeholdende fire kvadranter 3. Tilstødende kvadranter enten indeholdt testen ellerstyre stof. Som i de foregående assays, blev ormene immobiliseret ved indvirkning af natriumazid før bliver scoret. En lignende fremgangsmåde er beskrevet her som en måde at evaluere reaktion C. elegans til forskellige forbindelser. Men nedenstående metode har den ekstra fordel på kun vurdere orme, der har bestået en tærskel afstanden mellem mobil fra immobile orme. Andre analyser har indarbejdet lignende retningslinjer for at ignorere immobile orme. Frøkjær-Jensen et al. udviklet en alsidig assay, som kan anvendes til at teste både flygtige og vandopløselige forbindelser 10. En petriskål blev opdelt i fire kvadranter. Den øverste og nederste kvadranter ikke indeholder opløsningsmidler. Den venstre kvadrant indeholdt vand, og retten indeholdt lokkemidler. Ved testning af flygtige lugtstoffer blev analyt placeret på låget af fadet over den rette kvadrant, mens vandopløselige forbindelser blev placeret direkte på agar.. De metoder, i øjeblikket findes til evaluering kemotaktiske respons C. elegans bliver konstant forfinet til at optimere deres brugervenlighed, effektivitet og nøjagtighed. Så mens assayet beskrevet her, har evnen til at vurdere det største antal orme (maksimal kapacitet:. 250 orme / time pr plade, lidt større end gennemløb demonstreret af Lee et al 3), den virkelige styrke ved denne metode er den kortfattet kulminationen af mange af de attributter af tidligere assays (tabel 1).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoFuge</td>
 <td>Stratagene</td>
 <td>400552</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscopes</td>
 <td>Leica</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting</td>
 <td>Leica</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 Pipette</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P10 Pipette</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M Sodium Azide</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol/Distilled Water</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agar</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>166-0600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NH4Cl</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>CA97062-046</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>VWR</td>
 <td>CA12001-120</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NH4OH</td>
 <td>BDH</td>
 <td>CABDH8641-2</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Tween 20</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-6531</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

c. elegans chemotaxis assay

Mange organismer bruger chemotaxis at opsøge fødekilder, undgå skadelige stoffer, og finde kammerater. Caenorhabditis elegans har imponerende chemotaxis adfærd. Udgangspunktet bag teste respons orme til et lugtstof er at placere dem i et område, og observere bevægelsen fremkaldes som reaktion på et lugtstof. Selv med de mange tilgængelige analyser fortsat optimering ormen begynder placering i forhold til både kontrol og test områder samtidig minimere interaktionen af orme med hinanden, og samtidig opretholde en betydelig stikprøvestørrelse et arbejde i gang 1-10. Den her beskrevne metode har til formål at løse disse problemer ved at ændre analysen er udviklet af Bargmann et al. 1.. En petriskål er opdelt i fire kvadranter, der to modsatte kvadranter mærket &quot;Test&quot; og to betegnet &quot;Control&quot;. Bedøvelsesmiddel er placeret i al test-og kontrolsteder. Ormene er placeret i midten af ​​pladen med en CIRCLe markeret omkring oprindelsen at sikre, at nonmotile orme vil blive ignoreret. Udnytte en fire-kvadrant-system snarere end en 2 eller to 1 eliminerer forspænding i bevægelsen af ​​ormene, da de er lige langt fra test-og kontrolprøver, uanset hvilken side af oprindelsen de begyndte. Dette omgår problemet med orme bliver tvunget til at rejse gennem en klynge af andre orme til at reagere på et lugtstof, hvilket kan forsinke orme eller tvinge dem til at tage en mere omvej, hvilket giver en ukorrekt fortolkning af deres planlagte vej. Denne metode viser også praktiske fordele ved at have en større stikprøve og lade forskeren at køre analysen uden opsyn og score ormene når den tildelte tid er udløbet.

Sammenligning vildtype (N2) C. elegans til ODR-10 (KY10) mutanten. Vi brugte diacetyl, en kendt C. elegans kemoattraktant, at sammenligne vildtype orme som for en mutant, der mangler receptoren for diacetyl 1,12. For vildtype (N2) orme det kemotaktiske-indekset var 0.100 ± 0.066 til ethanol, og 0,839 ± 0,031 til 0,5% diacetyl. Som forventet, diacetyl fremkalder en betydelig chemoattractive respons fra vildtype orme (P &lt;0,003). I modsætning <e...

Watch this Scientific Journal Video about C. elegans Chemotaxis Assay at JoVE.com

C. elegans Chemotaxis Assay

En fremgangsmåde til kvantitativt at vurdere den kemotaktiske reaktion af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Beskrives. En kemotaktiske indeks (CI) blev ansat som en måde at præcist vurdere respons af orme, at visse mål, og tjene som en platform for sammenligning mellem stammer og forbindelser af interesse.

C. elegans Kemotaksi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Research

JoVE Journal

Biology

C. elegans Chemotaxis Assay

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

En fremgangsmåde til dyrkning Embryonale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarvning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Brug af &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Måling Effekter af bakterier på<em&gt; C. Elegans</em&gt; Behavior Ved hjælp af en Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...