Name: c. elegans chemotaxis assay
Uploaded: 2013-04-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about C. elegans Chemotaxis Assay at JoVE.com

Vi takker biovitenskap og Avdeling for kunst og vitenskap ved Queens University for finansiering dette arbeidet. Så vel, vi takker Chin-Sang laboratorium for å gi de nødvendige reagenser, utstyr og teknisk støtte. Vi takker også QGEM 2011, spesielt Tony Han for hans bidrag til diskusjonen.

En. Forberede / vaske Worms <ol><li> Synkronisere ormer til ung voksen 11. </li><li> Pipette 2 ml av S Basal på en 5 cm Chemotaxis plate av iscenesatte ormer som nettopp har ryddet plenen av OP50 E. coli. Vippe plate som nødvendig for å sikre ormene er vasket fra platen overflaten inn i bufferet. </li><li> Pipetter en ml av orm-S Basal løsning inn i et mikrosentrifugerør. </li><li> Sentrifuger i 10 sekunder ved hjelp av en PicoFuge ved 6600 rpm. </li><li> Aspirer S Basal, forlater pellet av or...

<ol>
	<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li><li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+preference+in+C.+elegans.">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+chemotaxis+responses:+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans.">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis.">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods:+Synchronization+and+Observation.">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (1895).</li></ol>

Chemotaxis, selv styres av et komplekst sett av neuronal og cellulære mekanismer, kan enkelt og objektivt kvantifiseres ved hjelp av kjemotaksen assays. For å oppnå de beste resultatene fra analysene, må visse viktige skritt tas. For det første, iscenesettelse ormer er viktig i gir konsistente eksperimentelle resultater. Worms på ulike livsstadier oppføre seg annerledes 13; så blandede scenen ormer kan skjeve eksperimentelle resultater. Dernest, som sikrer alle E. coli er vasket av ormer er a...

Ward først utviklet kjemotaksis analysen i 1973 fem, og siden da har det hatt vidtrekkende applikasjoner. Nevrobiologi er et felt som har dratt nytte av å bruke en rekke kjemotaksen analyser. Olfactory tilpasning, en enkel form for læring og hukommelse, har blitt vist i C. elegans med kjemotaksen analyser 6. De har også blitt brukt til å vise at C. elegans kan utvikle toleranse etanol-et resultat som ikke bare viser de atferdsmessige plastisitet av ormer, men som også viser at ormene kan være meget nyttig i studiet av alkohol-avhengighet hos mennesker tre. Analyser har også blitt utviklet for å demonstrere evnen som C. elegans å lagre kort og lang sikt minne ved å vise at foreninger er laget av ormer mellom chemoattractants og mat (OP50) 7. I tillegg gis det omfattende informasjon tilgjengelig om C. elegans genom, den chemotaxis oppførselen til C. elegans har blitt endret mange ganger ved å indusere mutasjoner 1,8. Dette gjør det mulig for mange spennende tekniske muligheter, slik som utviklingen av C. elegans som bioremediation verktøy. Således, ettersom den innledende utvikling av kjemotaksis-analyse i 1973 har det vært hyppig forandres og brukes til å belyse hemmeligheter i ulike disipliner. Enkelte analyser som mål å oppdage den spesifikke ruten tatt av ormer mot et mål. Det prototypiske analysen av denne type ble utviklet av Ward 5.. Tre ormer ble plassert på smeltet agar i 15 min. Deres bevegelser ble spores ved avtrykk de igjen på veien fra periferien av platen opp en gradient til et tiltrekningsmiddel i sentrum av platen. Alle ormer på plate arrestert anvendelse av kloroform ved slutten av hvert forsøk. En etterkommer av denne fremgangsmåte plasseres en enkelt orm i midten av platen med lokkemidlet og kontrollen ent like og motsatt avstander fra opprinnelsen to. Perforerings-Shimomura et al. utviklet en analyse for å observere den eksakte natur av bevegelsen som er involvert i chemotaxis 9.. Individuelle ormer ble plassert i 9 cm petriskåler inneholdende enten en ensartet konsentrasjon av lokkemidlet eller en radial gradient formet som kulminerer i kilden lokkemidlet. Et dataprogram som anerkjent ormen ble brukt til å spille inn den observerte atferden. Et videokamera tilknyttet et mikroskop arbeidet i forbindelse med trinn for å justere petriskål automatisk som analysen løp for å sikre ormen forble i synsfeltet. Fra dette, ble mer detaljert informasjon oppdaget om årsaken til piruetter vises av C. elegans. Andre analyser, mer lik den som er beskrevet her, testet responsen på en stor bestand av ormer å teste forbindelser. To-kvadrant kjemotaksen analysene erbrukes til å utforske de rollene som ulike nerveceller, reseptorer, og signalformidling molekyler spilt da C. elegans ble utsatt for forskjellige forbindelser en. 20-50 vaskede ormer ble plassert nær midten av platen med et tiltrekningsmiddel og en kontroll på polare ender sammen med bedøvelse, natriumazid (NaN 3). Etter 60 min, ble en kjemotaktisk indeks med verdier fra -1,0 til +1,0 genereres basert på forskjellen mellom hvor mange ormer ble festet til lokkemidlet eller kontrollen. En lignende kjemotaktisk indeksen ble benyttet i analysen rapportert i denne artikkelen, selv om den tidligere analysen sviktet strengt å evaluere ikke-motile ormer. Denne analysen ble deretter ytterligere anvendt for å teste effekten av neuronal ablasjon på kjemotaksis. En annen variant av den forannevnte prøven ble utført der 100-200 ormer ble plassert i midten av en plate som inneholder fire kvadranter 3. Tilstøtende kvadranter enten inneholdt test-ellerkontrollere substansen. Som i tidligere assays, ble ormene immobilisert ved virkningen av natriumazid før de ble avsluttet. En lignende metode er beskrevet her som en måte å evaluere responsen av C. elegans til ulike forbindelser. Imidlertid har metoden under den ekstra fordelen av bare vurdere ormer som har passert en terskel avstanden skille mobil fra immobile ormer. Andre analyser har innarbeidet lignende retningslinjer for ignorerer immobile ormer. Frøkjær-Jensen et al. utviklet en allsidig analyse som kan brukes til å teste både flyktige og vannløselige forbindelser ti. En petriskål ble delt i fire kvadranter. Den øverste og nederste kvadranter ikke inneholde løsemidler. Den venstre kvadrant inneholdt vann, og den høyre inneholdt lokkemidlet. Når du skal teste flyktige odorants ble analytten plassert på lokket av fatet, over riktig kvadrant, mens vannløselige forbindelser ble plassert direkte på agar. Metodene som finnes i dag for å vurdere kjemotaktisk respons C. elegans blir stadig raffinert å optimalisere deres brukervennlighet, effektivitet og nøyaktighet. Så, mens analysen beskrevet her har evnen til å vurdere det største antall ormer (maksimal gjennomstrømming:. 250 ormer / time per plate, litt større enn gjennomstrømningen demonstrert av Lee et al 3), den virkelige styrken til denne metoden er fyndig kulminasjonen av mange av attributtene av tidligere analyser (tabell 1).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoFuge</td>
 <td>Stratagene</td>
 <td>400552</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscopes</td>
 <td>Leica</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting</td>
 <td>Leica</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 Pipette</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P10 Pipette</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M Sodium Azide</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol/Distilled Water</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agar</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>166-0600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NH4Cl</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>CA97062-046</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>VWR</td>
 <td>CA12001-120</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NH4OH</td>
 <td>BDH</td>
 <td>CABDH8641-2</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Tween 20</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-6531</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

c. elegans chemotaxis assay

Mange organismer bruker kjemotaksis å oppsøke mat kilder, unngå skadelige stoffer, og finne kameratene. Caenorhabditis elegans har imponerende kjemotakse atferd. Forutsetningen bak teste responsen av ormer for en odorant er å plassere dem på et sted og observere bevegelsen fremkalt i respons på en odorant. Selv med de mange tilgjengelige analyser, noe som optimaliserer orm startposisjon i forhold til både kontroll-og test-områder, mens minimere interaksjonen av ormer med hverandre, samtidig som en betydelig prøvestørrelse forblir i arbeid 1-10. Metoden er beskrevet her tar sikte på å løse disse problemene ved å endre analysen utviklet av Bargmann et al. En. En petriskål er delt inn i fire kvadranter, er to motsatte kvadranter merket &quot;Test&quot; og to utpekte &quot;Control&quot;. Bedøvelse er plassert i alle test og kontroll nettsteder. De ormer er plassert i sentrum av platen med en circle merket rundt origo for å sikre at ikke-motile ormer vil bli ignorert. Utnytte en fire-kvadrant system snarere enn en to eller to en eliminerer skjevhet i bevegelsen av ormer, som de er like langt fra test og kontroll prøvene, uavhengig av hvilken side av opprinnelsen de begynte. Dette omgår problemet med ormer som blir tvunget til å reise gjennom en klynge av andre ormer å svare på en odorant, noe som kan forsinke ormer eller tvinge dem til å ta en mer omvei, noe som gir en uriktig tolkning av sin opprinnelige kurs. Denne metoden viser også praktiske fordeler ved å ha en større utvalgsstørrelse og tillater forskeren å kjøre analysen uten tilsyn og scorer ormer når den avsatte tiden er utløpt.

Sammenligning av villtype (N2) C. elegans til ODR-10 (KY10) mutant. Vi brukte diacetyl, en kjent C. elegans chemoattractant, å sammenligne villtype ormer som for en mutant som mangler reseptoren for diacetyl 1,12. For hvete (N2) ormer den kjemotaktiske indeksen var 0.100 ± 0.066 til etanol, og 0,839 ± 0,031 til 0,5% diacetyl. Som forventet, utløser diacetyl en betydelig chemoattractive respons fra vill type ormer (P &lt;0.003). I motsetning <em...

Watch this Scientific Journal Video about C. elegans Chemotaxis Assay at JoVE.com

C. elegans Chemotaxis Assay

Fremgangsmåte for kvantitativt å evaluere den kjemotaktiske respons<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Er beskrevet. En kjemotaktisk indeks (CI) ble anvendt som en måte å nøyaktig evaluere responsen av ormer til visse mål og som tjener som en plattform for sammenligning mellom stammene og forbindelser av interesse.

C. elegans Chemotaxis analysen

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Research

JoVE Journal

Biology

C. elegans Chemotaxis Assay

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

En metode for dyrking Embryonic<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarging i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Ved hjelp av &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Måle effekten av bakterier på<em&gt; C. Elegans</em&gt; Behavior Ved hjelp av en Egg Retention analysen

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...