Name: clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood at JoVE

Авторы хотели бы поблагодарить д-р Карл июня (Университет Пенсильвании) за помощью создания и обеспечения AAPC клон № 4 и д-р Перри Hackett (Университет Миннесоты) за помощь в системе СО. Грантовая поддержка: Cancer Center Основные Грант (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127), P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward фонда; Burroughs Wellcome фонда; Gillson Longenbaugh фонда; профилактике рака и научно-исследовательский институт Техас; ХЛЛ Global Research Foundation, Министерства обороны, усадьба Л. Noelan Библер, Гарри Т. Mangurian-младший, фонд лейкемии иммунотерапии, Институт персонализированной терапии рака, лейкемии и лимфомы общества; фонд лимфома исследований; MDACC сестра учреждение сети фонда; Миллер фонда, г-н Симонс травы, г-н и г-жа Joe H. весы, г-н Томас Скотт, Национальный фонд исследований рака, детской Фонд исследований рака; производство Assistancе для клеточной терапии (ПАКТ), Уильям Лоуренс и Фонд Blanche Hughes детей.

<html> День 0 или до 1. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) с РВ и UCB <ol><li> Развести PB с равным объемом и UCB с четырьмя объемами PBS-EDTA. </li><li> Медленно слой разбавленной крови (25 мл) на Ficoll (12 мл) в 50 мл центрифужные пробирки (ы) и центрифуги при 400 х г в течение 30 - 40 мин (без тормозов). </li><li> Сбор и передача мононуклеарных фракции клеток (интерфейс) с помощью пипетки передачи на свежую трубку центрифуги 50 мл. </li><li> Вызовите объемом до 50 мл PBS-ЭДТА и центрифугируют при 450 х г в течение 10 мин. </li><li> Аспирируйте супернатанта, мягко повторно приостановить осадок клеток (ы) в 50 мл полной среды культуры (СКК), а центрифуге при 400 х г в течение 10 мин. </li><li> Аккуратно повторно приостанавливать и бассейн ячейки гранул в СКК и выполнить подсчет клеток с использованием трипанового синего методом исключения (Cellometer, PBMC программы). </li><li> MNC теперь может быть использован для электропорации (Nucleofection) или криоконсервации для использования в будущем. </li></ol>Название &quot;&gt; 2. Подготовка Т-клеток для электропорации в день 0 <ol><li> При использовании криоконсервированных MNC, быстро таять достаточной клеток для электропорации полной шкалы (2 х 10 8 добавления ~ 20% к ответственности за потерю клеток при центрифугировании и 2 ч инкубации) в 37 ° С водяной бане. Если используется свежевыделенных МНК перейдите к шагу 2.3. </li><li> Аккуратно повторно приостановить и передать клеткам соответствующего размера центрифужные пробирки (ы), содержащиеся подогретого Полное фенол-Free RPMI культуре средств массовой информации (PF-RPMI) и центрифуги при 200 мкг в течение 10 мин (без тормозов), супернатант. </li><li> Повторное приостановить MNC в PF-RPMI, выполнить клеток (Cellometer) и передать клеток соответствующих размеров судна культуры клеток (ы) в концентрации 10 6 клеток / мл. </li><li> Инкубируйте в увлажненном 37 ° C / 5% CO 2 инкубаторе в течение 2 ч ± 30 мин. </li><li> Передача MNC в стерильную пробирку центрифуги (ы), спина при 200 мкг в течение 5 мин (без тормозов), аспирации супернатант и аккуратно гE-приостанавливать и объединить осадок клеток (ы) в PF-RPMI. </li><li> Выполните клеток (Cellometer) и рассчитать объем клеточной суспензии требуется (2 х 10 8 MNC). </li><li> Передача расчетного объема в стерильный 50 мл центрифужные пробирки и спина при 200 мкг в течение 10 мин (без тормозов). </li><li> Аспирируйте супернатанта, так что никаких остаточных средств массовой информации остается и осторожно повторно приостановить, нажав стороне трубки. </li></ol> 3. Электропорации (Nucleofection) из MNC (полный процесс шкале Используя 10 Кюветы) на день 0 <ol><li> Предварительная инкубация стерильных 12-луночный планшет с 10 скважин, содержащий 4 мл теплой PF-RPMI в увлажненном 37 ° C / 5% СО 2 инкубатора. </li><li> Подготовка и предварительно теплой Решение Lonza Nucleofector человека Т-клеток комплект (восстановленные в соответствии с инструкцией завода-изготовителя, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) до температуры окружающей среды в кабинет биобезопасности (BSC). </li><li> Подготовка Nucleofector решения / смеси ДНК мастер-надстройкаг 100 мкл дополнен решением Nucleofector, 15 мкг транспозонов (суперспиральной ДНК плазмиды, обозначенной как CD19RCD28/pSBSO) и 5 ​​мкг транспозазы (суперспиральной ДНК плазмиды, обозначенной как pCMV-SB11) в реакции / кювете. </li><li> Дисперсные осадок клеток (с шагом 2,8), слегка нажав сторону центрифужные пробирки и вновь приостановить Nucleofection решения / DNA Master Mix (Final концентрации клеток: 2 х 10 7 клеток/100 мкл). </li><li> Тщательно передачи 100 мкл клеточной суспензии (с шагом 3,4) для каждого из десяти (10) кювет Lonza Nucleofection, соблюдая осторожность, чтобы избежать пузырей. </li><li> Нажмите кювет один раз, и electroporate с помощью программы U-014 (для нестимулированных Т-клеток). </li><li> Передача кювет и 12-луночный планшет (шаг 3,1) в BSC. </li><li> Урожай электропорации клеток из каждой кювете использованием Amaxa штрафа пипетки передачи чаевые, добавив ~ 500 мкл предварительно нагретого культуральной среды от соответствующих хорошо (12-луночный планшет, подготовленный в Steстр. 3,1) и вернуть пластину к увлажненным 37 ° C / 5% CO 2 инкубаторе в течение 2 ч ± 30 мин. </li><li> После 2-часовой инкубации, сбор и передачу клеток из всех скважин в стерильную пробирку центрифуги. </li><li> Вымойте клеток путем центрифугирования при 140 мкг в течение 8 мин, температура окружающей среды, нет тормозов и аспирации и отбросить супернатант, чтобы не остатки среды охватывает осадок клеток. </li><li> Дисперсные осадок клеток, осторожно нажав сторону центрифужные пробирки и осторожно повторно приостанавливать в СКК для достижения одной клеточной суспензии. </li><li> Выполните клеток и регулировать концентрацию клеток до 10 6 клеток / мл в СКК. </li><li> Передача клеточной суспензии в культуре клеток колбу (ы) и место в инкубаторе в течение ночи. </li><li> Процесс шагах от 2,1 до 3,8 были повторены для управления: EGFP-трансфицированные клетки (5 х 10 6 клеток / кювету с 5 мкг Amaxa управления EGFP суперспирализованной плазмиды, pmaxGFP). </li></ol> 1-й день 1-й и последующиеСтимуляция Циклы 4. Анализ CAR выражений с помощью проточной цитометрии на 1 день <ol><li> Урожай электропорации клетки и осуществляют подсчет клеток с использованием трипанового синего метод исключения (гемоцитометр). </li><li> Пятно клетки (1, 2 х 10 6) с антителами, специфичными для CD3, CD4, CD8, и человеческий IgG Fcγ (как измерение CAR выражение). </li><li> Приобретать клеток на FACS Calibur и анализировать данные с помощью FCS Экспресс программное обеспечение для расчета выражения CAR. <ol><li> Рассчитать клетки CAR + в культуре по формуле: (Кол-во Всего жизнеспособных клеток) х (% CAR + клеток) = Кол-во CAR + клеток </li></ol></li></ol> 5. Подготовка AAPC (клон № 4) на 1 день. AAPC (клон № 4) были получены из клеток К562 (Родительский линии, полученной от американских Type Culture Collection) для Co-экспресс Желаемые Т-клеток костимулирующих Molecule <ol><li> Оттепель аликвоты замороженным 100 Гр облучения AAPC в 37 °, С водяной бане. </li><li> Клетки дважды промывают с помощью центрифугирования при 400 мкг, 10 мин в СКК и рассчитывали с использованием Cellometer (трипанового синего исключения). </li><li> Рассчитайте количество жизнеспособных AAPC необходимых для стимуляции: (Кол-CAR + клеток) х 2 = Количество облученных AAPC требуется </li></ol> 6. AAPC-опосредованная стимуляция CAR + Т-клеток на 1 день начала 1-го и последующих циклов стимуляции <ol><li> Смешать электропорации клеток (выражение CAR) и γ-облученных AAPC (клон № 4) в стерильный контейнер в соотношении 1:2 (CAR + клеток: жизнеспособные AAPC) в СКК. <ol><li> Обратите внимание на соотношение AAPC приспособлен для выражения автомобиль на базе проточной цитометрии на следующий день после электропорации. </li></ol></li><li> Добавить IL-21 (30 нг / мл) к клеточной суспензии. </li><li> Алиготе в T-75 см 2 колбы (ы) и / или Vue Жизнь Культура сумки в концентрации 10 6 клеток / мл и вернуться к incubatили. </li></ol> Дни 3, 5 7. Продолжение культуры CAR + Т-клеток <ol><li> Выполните половины средств массовой информации изменения, пополнить IL-21, и поддерживать Т-клеток в концентрации 10 6 клеток / мл. </li></ol> День 7 8. Конец первого AAPC-опосредованной стимуляции цикла <ol><li> Урожай клетки, считать и пятна на CD3, CD4, CD8, и Fcγ (CAR) и перейдите к пункту 10.1. </li></ol> 9. Истощение CD56 + клеток (обычно между 7 и 14 дней после электропорации) <ol><li> Выполните CD56 истощения использованием парамагнитных бисера, если CD56 + CD3 нег лимфоцитов ≥ 10%. </li></ol> Стимуляция Циклы № 2, № 3, № 4 и отвечающих дней 8 → 14, 15 → дней 21, и Дней 22 → 28 10. Рекурсивные Добавление AAPC распространяться Т-клеток клинически достаточном количестве <ol><li> Повторите stimulatioп процесс (4 раза), как описано в шагах 4.3-8.1. </li><li> Добавить IL-2 (50U/ml) в культурах начинается на 7, 14 и 21, и то при каждой смене носителя (три раза в неделю, в понедельник-среда-пятница график). </li><li> Криоконсервируют (архив) избыток Т-клеток по мере необходимости. <ol><li> Т-клетки заморожены с использованием контролируемого морозильной камеры скорости. </li></ol></li></ol> День 28 11. Конце прошлого AAPC-опосредованной стимуляции цикла: Клетки Harvest T <ol><li> Криоконсервируют Т-клетки для тестирования выпуска и инфузий. </li></ol>

<ol>
	<li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor.">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li><li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells:+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held.">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li><li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs+on+track+in+the+clinic.">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li><li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sleeping+Beauty+transposon+system:+a+non-viral+vector+for+gene+therapy.">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li><li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies:+victories+and+challenges.">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies.">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li><li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States.">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li><li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes.">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li><li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty,+a+Tc1-like+transposon+from+fish,+and+its+transposition+in+human+cells.">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li><li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+transposition:+biology+and+applications+for+molecular+therapy.">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li><li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li><li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies.">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li><li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li><li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor.">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li><li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies.">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs:+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity.">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li><li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system.">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li><li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor.">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li><li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases.">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li><li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19++lymphoid+malignancies.">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li><li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes.">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li><li>Hackett, P. B., Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies.">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li><li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules.">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li><li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells.">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Транспозонов и транспозазы систем, например, от PiggyBac 12,19 и SB 18,20-22, не являются вирусные подходы к генной терапии, которые являются альтернативой вирусно-опосредованной трансдукции клинического класса CAR + Т-клеток. SB был выбран в качестве системы переноса генов на основе ее потенциал для генной терапии человека 1,6,23. Мы разработали технологии двойного СО транспозиции (ввести CAR) и рекурсивным добавлением γ-облученных AAPC (для получения генетически модифицированных Т-клеток, стабильно экспрессирующих CAR) в качестве платформы технологии в производстве ТАА Т-клеток в соответствии с цГМФ для фазы I / II испытаний (рис. 4). Через 28 дней (четыре 7-дневный цикл стимуляции) совместного культивирования на γ-облученных AAPC, мы, как правило, способны генерировать по крайней мере ~ 10 10 генетически модифицированные Т-клетки пригодны для человека приложений. В случае необходимости, дополнительных циклов стимуляции могут быть предприняты тО генерировать большее количество генетически модифицированных Т-клеток. Кроме того, если меньше CAR + Т-клетки необходимы, подход к электропорации и распространения могут быть сокращены используя меньшее количество кювет и дальнейшего только к югу от набора численно расширил Т-клеток для последующих раундах распространения на AAPC в начале каждого Стимуляция цикла. Большинство электропорации и распространяется Т-клеток, собранных для инфузий стабильно выразить ЦАР. Следствием CD4 + и CD8 + Т-клеток, экспрессирующих наш 2-го поколения автомобиля включает клетки с памятью / наивные фенотип и проявляет три клейма повторного направлены специфику. Во-первых, генетически модифицированные Т-клеток, в частности лизиса CD19 + цели, во-вторых, производят IFN-γ в ответ на CD19 + клеток стимулятором и, в-третьих, размножаются в ответ на CD19 + фидерных клеток, все в CAR-зависимым способом 13,18. Наш подход к Integrели CAR трансгенов электро-передачи не-вирусной ДНК плазмиды из SB системы могут быть предприняты в покоящихся первичных Т-клеток, полученных из PB и UCB. Мы и другие генетически модифицированные клетки К562 в качестве AAPC эффективно распространять клинически достаточное количество Т-клеток для инфузий 24,25. AAPC и культуры тканей среды (например, добавление IL-21) были были изменены для создания пациента и донора, полученные CD19-специфических Т-клеток для инфузий после гемопоэтических стволовых клеток (табл. 1) 13,18. Мы можем производить CAR + Т-клеток от PB просто получить из вены, которая позволяет избежать затрат, дискомфорт и неудобство получения MNC от PB по афереза. Возможность получить большое количество CAR + Т-клетки из небольшого числа МНК является особенно привлекательным для вливания Т-клеток после трансплантации аллогенных UCB. Небольшой размер и анонимности донора новорожденных исключает повторной-Доступа этого лица в более поздний момент времени, и только ограниченное количество заготовленной MNC доступны в качестве исходного материала для производства T клетки, чтобы избежать вмешательства кроветворения. Дальнейший прогресс в производственном процессе В настоящее время ведутся включить устройство высокой пропускной электропорации в сочетании с полностью закрытым WAVE биореактор, чтобы свести к минимуму обращения. В совокупности, СО и AAPC являются привлекательными платформами для создания CD19 конкретных CAR + Т-клеток, которые могут быть адаптированы для создания большого количества генетически модифицированных Т-клеток, которые могут признать альтернативные клеточной поверхности ТАА в соответствии с цГМФ.

<table border="1"><tbody><tr><td> Реагенты </td><td> Продавец </td><td> Номер в каталоге </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Реагенты </td></tr><tr><td> ДНК плазмиды GFP выражая (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (комплект) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Сигма </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Фенол бесплатно RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone фетальную телячью сыворотку </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Рекомбинантного человеческого IL-21 </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> Рекомбинантного человеческого IL-2 (Пролейкин) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Т-клеток человека Kit (Nucleofector Solution) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 реагентов </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-конъюгированные с мышью мАт, специфичных для человека CD3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-конъюгированных с мышью мАт, специфичных для человека CD4 </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-сопряженныхдля мыши мАт, специфичных для человека CD8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-конъюгированные с F (аb &#39;) 2-фрагмент из козьего антитела, специфичные для человека Fcγ </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Азид натрия </td><td> Сигма </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Одноразовые </td></tr><tr><td> 12-луночный планшет </td><td> Гранулирование </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 см 2 колбы </td><td> Гранулирование </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Культура сумки </td><td> Vue жизни </td><td> 290C, 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 мл центрифужные пробирки </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><sЧонг&gt; Оборудование </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom Bioscience </td><td> Cellometer Видение </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legend RT центрифуги </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Контролируемая морозильной камеры скорости </td><td> Строгальщик </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Облучатель </td><td> СНГ био Международного </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Экспрессию молекул (эндогенные и внедряемых) </td></tr><tr><td> Клеточная линия </td> &lt;TD&gt; Common Name </td><td> Тип клетки </td><td> Молекулы Выразил </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Клон 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP совместно с мембранным выразил связаны IL-15 </td></tr></tbody></table> Полный медиа-культуры (CCM) (хранить при 4 ° С в течение до 30 дней) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1% Glutamax Проточной цитометрии буфер (хранить при 4 ° С в течение до 30 дней) PBS 2% FBS 0,1% азид натрия </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Мы сообщаем, что электро-передачи ДНК плазмиды и распространения Т-клеток на γ-облученных AAPC может быть использован для создания клинически привлекательным количество Т-клеток, полученных из PB и UCB для человека приложений. Эти генетически модифицированные Т-клетки выразить представила автомобиль, который признает ТАА CD19, независимый от главного комплекса гистосовместимости. SB-производных плазмиды ДНК, чтобы выразить (I) транспозонов, 2-го поколения CAR (CD19RCD28), что сигналы через CD28 и CD3-ε 14, и (II) транспозазы, SB11 15, были описаны ранее 13, 16,17 . Плазмиды, используемые в настоящем исследовании были произведены коммерчески Вайсман клинической фонда Biomanufacturing (Мэдисон, Висконсин). AAPC (клон № 4), полученные из клеток К562 (родительские линии, полученной от американских Type Culture Collection), со-экспресс желаемого Т-клеток стимулирующих молекул (каждая молекула представила на 3 90% на клеточной поверхности AAPC),как описано выше 12. Здесь мы показываем, что CD19-специфичных Т-клетки могут быть получены из мононуклеарных клеток (МНК), полученные из ДСП или UCB использовании SB транспозиции ввести CAR с последующим добавлением AAPC численно расширить Т-клеток в CAR-зависимым способом (рис. 1 , 4) 13,18. Десять кювет (2x10 7 MNC / кювета) являются электропорации для каждого получателя с использованием 15 мкг ДНК плазмиды (CD19RCD28/pSBSO), кодирующий транспозонов (CAR) и 5 мкг ДНК плазмиды (pCMV-SB11), кодирующий транспозазы (SB11). Количество кювет может быть уменьшен, если ТНК ограничивают или сокращены для лабораторных работ. В день электропорации определяется как &quot;День 0&quot; Стимулирование цикла № 1. В качестве контроля для проточной цитометрии и культура условиях, аутологичных Т-клетки макет электропорации (без ДНК плазмиды) и численно расширена на γ-облученных AAPC (клон № 4), которые были предварительно загружены OKT3 перекрестной ссылки CD3 для поддержания Т-клеток распространения. Мы гoutinely оценки эффективности электропереноса и жизнеспособность Т-клеток, на следующий день после электропорации (рис. 2В). Выражение EGFP из контрольной ДНК плазмиды (назначенный pmaxGFP) и CAR в это начальная точка времени отражает экспрессию белка из интегрированной и эписомные плазмиды. Как правило, на следующий день после электропорации мы измеряем EGFP выражении на ~ 60% и ЦАР выражении на ~ 40% (рис. 2A) с Т-клеточной жизнеспособности 40-50%. Рекурсивные добавления γ-облученных AAPC в присутствии растворимого рекомбинантного человеческого ИЛ-2 и ИЛ-21 получить Т-клеток, стабильно экспрессирующих CAR (CD19RCD28). CD3 нег CD56 + NK-клетки истощаются от культуры с использованием CD56 конкретных бисером парамагнитного если процент этих NK клеток ≥ 10% и, особенно, если процент CAR экспрессируется на Т-клетках низка. Это истощение предотвращает быстрое разрастание клеток NK, которая препятствует способности AAPC для поддержания proliferatioп CAR + Т-клеток. В некоторых случаях, истощение NK клеток из CAR + Т-клеток осуществляется в течение двух последних циклов стимуляции, но это вносит потери желаемых клеток за счет ко-экспрессии CD56 на некоторых CAR + Т-клеток. Т-клетки были выращены в функционально замкнутых системы с помощью Vue мешки Жизнь культуре прошлого День 14. Подмножество генетически модифицированных и распространяется Т-клеток, как правило, криоконсервированы на 14 день или День 21 (конец стимуляции цикла № 2 или № 3) совместного культивирования на AAPC в качестве источника архивного материала для будущего анализа и быть талых если непредвиденные проблемы впоследствии возникнуть в процессе производства. Т-клетки, как правило, собирают на или о 28-й день культуры (рис. 3), которые обычно выражают&gt; 90% автомобиля и&gt; 80% жизнеспособных (рис. 2, D). Ранее нами было показано, что после четырех недель совместного культивирования на AAPC средний раз-расширения CD3 + T клеток 19800 ± 11313 с CA<html> R + выражении составляет 90% ± 7,5 13. Эти Т-клетки криоконсервации и проходят в процессе производства и выпуска тестирование, которое информирует о безопасности и терапевтический потенциал выпускаемой продукции. Выпуск тестирование проводится в соответствии с клинической лаборатории улучшение поправки (CLIA), чтобы создать сертификат анализа до вливания в получателям на клинические испытания. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Рисунок 1. Шаги описанием процесса electroporate и распространять CAR + Т-клетки из PB и UCB. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите, чтобы увеличить показатель</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Рисунок 2. Характеристика генетически модифицированные Т-клетки из PB. (A) Выражение EGFP в день 0 первого цикла стимуляции для оценки эффективности переноса генов. Экспрессия CD19-конкретного автомобиля (CD19RCD28), как оценивали с помощью проточной цитометрии на CD3 +, CD8 + и CD4 + Т-клеток в (B) примерно через 24 часа после электропорации и (C) 28 дней после совместного культивирования на AAPC. Похожие выражение CAR наблюдалось с UCB-производных Т-клеток. (D) Кинетика CAR выражение. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите, чтобы увеличить показатель</a> . <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Рисунок 3. Распространение PB-производных CAR+ Т-клеток. Курс цифровой расширение CD3 + и ЦАР + T клетки, полученные из PB повторной совместного культивирования на γ-облученных AAPC в присутствии рекомбинантного человеческого растворимого IL-2 и Ил-21. Вверх стрелки указывают добавки γ-облученных AAPC отметить, что в начале каждого цикла стимуляции. UCB-производных CAR + Т-клетки имеют сходные темпы цифровой экспансии. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Рисунок 4. Схема производственного процесса с использованием СО и AAPC системах генетически модифицировать и распространять CAR + T клетки, полученные из PB и UCB. CD19 конкретных CAR + Т-клетки были получены от электро-передачи SB-суперспиральной, полученных плазмид ДНК и последующего совместного культивирования на К562 полученных AAPC (клон № 4) в присутствии OF рекомбинантного человеческого растворимого IL-2 и Ил-21. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Нажмите, чтобы увеличить показатель</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> T исходной ячейки </td><td width="9"> Транспозонов * </td><td width="9"> Транспозазы </td><td width="26"> Т-клеток инфузий </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Аутологичных (пациент происхождения) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> После аутологичных гемопоэтических стволовых клеток </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Аллогенных (донорских происхождения) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> После аллогенной трансплантации стволовых клеток </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><tD&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Аллогенных (донорских происхождения) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> После аллогенной трансплантации пуповинной крови пуповины </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Таблица 1. Клинические испытания под эгидой FDA на MDACC влить CD19-клеток конкретной CAR + T распространяется на AAPC. Т-клетки оказываются специфические для CD19 через насильственное выражение SB транспозона кодирование для 2-го поколения CAR, назначенный CD19RCD28, что сигналы через CD28 и CD3-ε. ** Судебная описано в ссылке 5.

Watch this Scientific Journal Video about Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood at JoVE

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T клетки, экспрессирующие CD19 конкретных химерный рецептор антигена (CAR) переплетаются в качестве исследуемого лечения В-клеточных злокачественных новообразований в нашей первой в человеческих испытаний генной терапии. Мы описываем генетической модификации Т-клеток помощью<em&gt; Спящая красавица</em&gt; (SB) системы внедрения CD19-конкретный автомобиль и селективного распространения на дизайнерские CD19 + искусственное антиген представляющих клеток.

Клиническое применение<em&gt; Спящая красавица</em&gt; И искусственный антиген-представляющие клетки генетически модифицировать T клеток из периферической и пуповинной крови

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig основе искусственного антиген представляющих клеток для эффективного Исключая виво Расширение прав CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Расширение периферической крови человека γδ T клеток с использованием Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Расширение цитотоксических Т-лимфоцитов из пуповинной крови, что целевая цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр Вирус, и аденовирус

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Искусственные антигенпрезентирующей клетки (AAPC) Активация опосредованной и расширение естественных клеток-T убийца

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Выделение предшественника В-клеточных подмножеств из пуповинной крови

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного<em&gt; In Vitro</em&gt; Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Генерация человека Аллоантиген-специфических Т-клеток из периферической крови

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Разработка Антиген-ведомой колита моделью для изучения Презентация антигенами путем антигенпрезентирующих клеток, Т-клеткам

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Высоко мультиплексированная, высокоразрешающая визуализация т-клеток с использованием madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Мегакариоцитов дифференциации и образование тромбоцитов от человека пуповинной крови производные CD34 клетки+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...