Name: clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood at JoVE

Författarna vill tacka Dr Carl juni (University of Pennsylvania) för att få hjälp att generera och ge AAPC klon # 4 och Dr Perry Hackett (University of Minnesota) för att få hjälp med SB-systemet. Bidragsstöd: Cancer Center Kärna Grant (CA16672), RO1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127), P01 (CA148600), SPORE (CA136411), Albert J Ward Foundation, Burroughs Wellcome Fund, Gillson Longenbaugh Foundation, Cancer Prevention och Forskningsinstitut Texas, CLL Global Research Foundation, försvarsdepartementet, dödsbo Noelan L. Bibler, Harry T. Mangurian, Jr, fonden för leukemi immunterapi, Institutet för Personlig Cancer Therapy, leukemi och lymfom Society, Lymfom Research Foundation; MDACC Syster Institution Network fonden, Miller Foundation, Mr Herb Simons, Mr och Mrs Joe H. Vågar, Thomas Scott, Nationella stiftelsen för cancerforskning, barncancer Research Foundation, Produktion assistance för cellulära terapier (Pact), William Lawrence och Blanche Hughes Barnens Foundation.

<html> Dag 0 eller före 1. Isolering av mononukleära celler (MNC) från PB och UCB <ol><li> Späd PB med lika volym, och UCB med fyra volymer av PBS-EDTA. </li><li> Långsamt skikt utspädda blodet (25 ml) på Ficoll (12 ml) i en 50 ml centrifugrör (er) och centrifugera vid 400 xg under 30 - 40 min (ingen broms). </li><li> Samla in och överföra den mononukleära cellfraktionen (gränssnitt) med användning av en överföringspipett till ett färskt 50 ml centrifugrör. </li><li> Ta upp volymen till 50 ml med PBS-EDTA och centrifugera vid 450 xg under 10 minuter. </li><li> Aspirera supernatanten försiktigt återsuspendera cellpelleten (er) i 50 ml Complete Odlingsmedier (CCM), och centrifugera vid 400 xg under 10 minuter. </li><li> Försiktigt återsuspendera och pool cellen pellets i CCM och utföra en cellräkning med trypanblåexklusion metoden (Cellometer, PBMC-programmet). </li><li> MNC kan nu användas för elektroporering (Nucleofection) eller kryokonserveras för framtida användning. </li></ol>titeln &quot;&gt; 2. Beredning av T-celler för elektroporering på dag 0 <ol><li> Vid användning kryokonserverade MNC, snabbt tina tillräckligt många celler för en fullskalig elektroporering (2 x 10 8 tillsats ~ 20% för att ta hänsyn till cellförlust under centrifugering och 2 h inkubation) i 37 ° C vattenbad. Om du använder nyisolerade MNC vidare till steg 2,3. </li><li> Försiktigt återsuspendera och överföra celler till en lämpligt dimensionerad centrifugrör (er) som ingår förvärmda Komplett Fenol-fritt RPMI odlingsmedium (PF-RPMI) och centrifugera vid 200 xg under 10 minuter (ingen broms), aspirat supematant. </li><li> Återsuspendera MNC i PF-RPMI, utför en cellräkning (Cellometer) och överför celler till en lämplig storlek cellkultur kärl (er) vid en koncentration av 10 6 celler / ml. </li><li> Inkubera i en fuktad 37 ° C / 5% CO 2 inkubator under 2 timmar ± 30 minuter. </li><li> Överför MNC till sterilt centrifugrör (er), centrifugera vid 200 xg under 5 minuter (inga bromsar), aspirera supernatanten och försiktigt re-suspend och kombinera cellpelleten (er) i PF-RPMI. </li><li> Utför en cellräkning (Cellometer) och beräkna volymen av cellsuspensionen krävs (2 x 10 8 MNC). </li><li> Överför den beräknade volymen till ett sterilt 50 ml centrifugrör och centrifugera vid 200 xg under 10 minuter (ingen broms). </li><li> Aspirera supernatanten så att inga rester medier kvarstår och försiktigt återsuspendera genom att knacka sidan av röret. </li></ol> 3. Elektroporation (Nucleofection) i MNC (Full Scale process med 10 Kyvetter) på dag 0 <ol><li> Pre-inkubera en steril 12-brunnars platta med 10 brunnar innehållande 4 ml varm PF-RPMI i en fuktad 37 ° C / 5% CO-2-inkubator. </li><li> Förbered och pre-värm Lonza Nucleofector Solution human T-cell-kit (rekonstitueras enligt tillverkarens instruktioner, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) till rumstemperatur i en biosäkerhet skåp (BSC). </li><li> Bered Nucleofector lösning / DNA Master Mix genom adding 100 ul kompletteras Nucleofector lösning 15 pg transposon (supertvinnad DNA-plasmid betecknas CD19RCD28/pSBSO) och 5 pg av transposas (supertvinnad DNA-plasmid betecknas pCMV-SB11) per reaktion / kyvett. </li><li> Dispergera cellpelleten (från steg 2,8) genom att försiktigt knacka på sidan av centrifugröret och återsuspendera i Nucleofection lösning / DNA-huvudblandning (Slutlig cellkoncentration: 2 x 10 7 celler/100 pl). </li><li> Töm 100 pl av cellsuspensionen (från steg 3,4) till vardera av tio (10) Lonza Nucleofection kyvetter, var noga med att undvika bubblor. </li><li> Tryck på kyvetten gång och elektroporera använda programmet U-014 (för ostimulerade T-celler). </li><li> Överför kyvetter och den 12-brunnars platta (steg 3,1) till BSC. </li><li> Skörda de elektroporerade cellerna från varje kyvett med hjälp av en fin Amaxa pipettspets överföring, genom att tillsätta ~ 500 | il av den förvärmda odlingsmedium från motsvarande väl (12-brunnars platta framställd i Stes. 3,1) och återföra plattan till en fuktad 37 ° C / 5% CO 2 inkubator under 2 timmar ± 30 minuter. </li><li> Efter 2-h inkubation, skörd och överföra cellerna från alla brunnar till ett sterilt centrifugrör. </li><li> Tvätta cellerna genom centrifugering vid 140 x g under 8 minuter, omgivningstemperatur, ingen broms och aspirera och kassera supernatanten så att ingen kvarvarande mediet omfattar cellpelleten. </li><li> Dispergera cellpelleten genom att försiktigt knacka på sidan av centrifugröret och försiktigt återsuspendera i CCM att uppnå en enkelcellsuspension. </li><li> Utför cellantal och justera cellkoncentrationen till 10 6 celler / ml i CCM. </li><li> Överför cellsuspensionen till cellodling kolv (ar) och plats i inkubator över natten. </li><li> Processteg 2,1 till 3,8 upprepades för styrning: EGFP-transfekterade celler (5 x 10 6 celler / kyvett med 5 pg Amaxa kontroll EGFP supertvinnad plasmid, pmaxGFP). </li></ol> Dag 1 av 1: a och efterföljandeStimuleringscykler 4. Analys av CAR expression genom flödescytometri på dag 1 <ol><li> Skörda de elektroporerade cellerna och utföra en cellräkning med användning av Trypan blå exklusionsmetoden (hemocytometer). </li><li> Stain celler (1 till 2 x 10 6) med antikropp specifik för CD3, CD4, CD8 och humant IgG Fcy (som ett mått på CAR uttryck). </li><li> Förvärva celler på FACS Calibur och analysera data med hjälp av FCS Express programvara för att beräkna uttryck av bil. <ol><li> Beräkna celler CAR + i kultur med formeln: (Antal Totalt livsdugliga celler) x (% CAR + celler) = Antal CAR + celler </li></ol></li></ol> 5. Framställning av AAPC (klon # 4) på ​​dag 1. AAPC (klon # 4) erhölls från K562-celler (Parental linje som erhölls från American Type Culture Collection) till Co-Express Önskad T cell samstimulerande molekyl <ol><li> Tina en alikvot av fryst 100 Gy bestrålade AAPC i en 37 °, C vattenbad. </li><li> Cellerna tvättas två gånger genom centrifugering vid 400 xg, 10 min i CCM och räknades med användning av Cellometer (trypanblått uteslutning). </li><li> Beräkna antalet livskraftiga AAPC krävs för stimulering: (Antal CAR + celler) x 2 = Antal bestrålat AAPC krävs </li></ol> 6. AAPC-medierad stimulering av CAR + T-celler på dag 1 med den 1: a och efterföljande cykler Stimulering <ol><li> Blanda elektroporerade celler (som uttrycker CAR) och γ-bestrålade AAPC (klon # 4) i en steril behållare vid ett förhållande av 1:2 (CAR + celler: livskraftiga AAPC) i CCM. <ol><li> Notera AAPC förhållandet justeras för expression av CAR baserad på flödescytometri dagen efter elektroporering. </li></ol></li><li> Lägg IL-21 (30 ng / ml) till cellsuspensionen. </li><li> Alikvot i T-75 cm 2 kolv (ar) och / eller Vue Life påsar odling vid en koncentration av 10 6 celler / ml och återgå till incubateller. </li></ol> Dagar 3, 5 7. Fortsatt Kultur av CAR + T-celler <ol><li> Utför en halv-media förändring, fylla IL-21, och upprätthålla T-celler vid en koncentration av 10 6 celler / ml. </li></ol> Dag 7 8. Slutet av första AAPC-medierad stimulering cykel <ol><li> Harvest celler, räkna och fläckar på CD3, CD4, CD8 och Fcy (CAR) och gå vidare till steg 10,1. </li></ol> 9. Utarmning av CD56 + celler (vanligen mellan 7 och 14 dagar efter elektroporering) <ol><li> Utför en CD56 utarmning med paramagnetiska pärlor om CD56 + CD3 neg lymfocyter ≥ 10%. </li></ol> Stimuleringscykler # 2, # 3, &amp; # 4 Motsvarande Days 8 → 14, Days 15 → 21, och dagar 22 → 28 10. Rekursiv Tillsättning av AAPC att fortplanta T-celler till kliniskt-tillräckligt antal <ol><li> Upprepa stimulatioN-processen (4 gånger) såsom beskrivits i steg 4,3-8,1. </li><li> Lägg IL-2 (50U/ml) till kulturerna börjar på dag 7, 14 och 21, och sedan vid varje media förändring (tre gånger i veckan, på en måndag-onsdag-fredag ​​schemat). </li><li> Cryopreserve (arkiv) överskott T-celler behövs. <ol><li> T-celler frystes med kontrollerad hastighet frys. </li></ol></li></ol> Dag 28 11. Slutet av förra AAPC-medierad stimulering Cykel: Harvest T-celler <ol><li> Cryopreserve T-celler för övergång testning och infusion. </li></ol>

<ol>
	<li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor.">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li><li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells:+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held.">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li><li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs+on+track+in+the+clinic.">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li><li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sleeping+Beauty+transposon+system:+a+non-viral+vector+for+gene+therapy.">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li><li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies:+victories+and+challenges.">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies.">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li><li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States.">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li><li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes.">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li><li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty,+a+Tc1-like+transposon+from+fish,+and+its+transposition+in+human+cells.">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li><li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+transposition:+biology+and+applications+for+molecular+therapy.">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li><li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li><li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies.">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li><li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li><li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor.">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li><li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies.">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs:+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity.">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li><li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system.">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li><li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor.">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li><li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases.">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li><li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19++lymphoid+malignancies.">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li><li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes.">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li><li>Hackett, P. B., Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies.">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li><li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules.">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li><li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells.">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Transposon och transposas system, såsom från piggyBac 12,19 och SB 18,20-22, är icke-virala metoder för genterapi som är ett alternativ till viralt medierad transduktion av klinisk kvalitet CAR + T-celler. SB valdes som genöverföring baserat på dess potential för human genterapi 1,6,23. Vi utvecklade de dubbla teknologier SB införlivande (att införa en bil) och rekursiv tillsättning av γ-bestrålade AAPC (att hämta genetiskt modifierade T-celler som stabilt uttrycker en bil) för att tjäna som plattform teknik i tillverkningen av TAA-specifika T-celler i enlighet med cGMP för fas I / II-studier (Figur 4). Efter 28 dagar (fyra 7-dagars stimulering cykler) av samodling på γ-bestrålade AAPC är vi vanligtvis kan generera minst ~ 10 10 genetiskt modifierade T-celler som lämpar sig för användning på människor. Vid behov kan ytterligare stimulans cykler genomföras to skapa större antal genetiskt modifierade T-celler. Dessutom, om mindre CAR + T-celler behövs, kan inställning till elektroporering och förökning skalas tillbaka anställa färre kyvetter och överföring bara en delmängd av de numeriskt expanderade T-celler för efterföljande omgångar av proliferation på AAPC i början av varje Stimulering cykel. Majoriteten av elektroporerades och fortplantas T-celler som skördats för infusion stabilt uttrycka CAR. Den utväxt av CD4 + och CD8 + T-celler som uttrycker våra 2 CAR andra generationens inkluderar celler med ett minne / naiv fenotyp och uppvisar tre kännetecken omdirigeras specificitet. För det första genetiskt modifierade T-cellerna lyserar specifikt CD19 + mål, dels producera IFN-γ som svar på CD19 + stimulatorceller och tredje proliferera som svar på CD19 + matarceller, allt i en CAR-beroende sätt 13,18. Vårt förhållningssätt till integråt en CAR transgen genom elektro-överföring av icke-virala DNA plasmider från SB-systemet kan ske i vilande primära T-celler som härrör från PB och UCB. Vi och andra har modifierats genetiskt K562 celler att fungera som AAPC att effektivt sprida kliniskt tillräckligt antal T-celler för infusion 24,25. Den AAPC och vävnadsodling miljö (t.ex. tillägg av IL-21) har har modifierats för att generera patient-och donor-härledda CD19-specifika T-celler för infusion efter hematopoetisk stamcellstransplantation (tabell 1) 13,18. Vi kan producera CAR + T-celler från PB enkelt erhålles genom venpunktion som undviker kostnaden, obehag och besvär att få MNC från PB genom aferes. Förmågan att härleda ett stort antal CAR + T-celler från ett litet antal MNC är särskilt tilltalande för infusion T-celler efter allogen UCB transplantation. Den lilla storleken och anonymitet den neonatala givaren utesluter re-Åtkomst denna person vid ett senare tidpunkt och endast ett begränsat antal skördade MNC finns som utgångsmaterial för T-cell tillverkning för att undvika att störa blodbildningen. Ytterligare förskott till tillverkningsprocessen pågår för närvarande för att inkludera en hög enhet genomströmning elektroporation kombination med en helt stängd WAVE bioreaktor för att minimera hanteringen. Sammanlagt är SB och AAPC tilltalande plattformar för att skapa CD19-specifik CAR + T-celler som kan anpassas för att skapa stora mängder genetiskt modifierade T-celler som kan känna igen alternativa cellytan TAA i enlighet med cGMP.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Leverantör </td><td> Katalognummer </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> DNA-plasmid som uttrycker GFP (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (byggsats) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70.026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol fritt RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone fetalt bovint serum </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant humant IL-21 </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant humant IL-2 (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Human T-cell Kit (Nucleofector lösning) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 Reagens </td><td> Miltenyi </td><td> 70.206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-konjugerat till mus-mAb specifik för humant CD3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349.201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-konjugerad till mus-mAb specifikt för humana CD4 </td><td> BD Biosciences </td><td> 340.443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-konjugeradtill mus-mAb specifik för humant CD8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 341.051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-konjugerat F (ab &#39;) 2-fragment av get-antikropp specifik för humant Fcy </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Förbrukningsmateriel </td></tr><tr><td> 12-brunnars platta </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm 2 kolv </td><td> Corning </td><td> 430.641 </td><td></td></tr><tr><td> Kultur kassar </td><td> Vue Livet </td><td> 290C; 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml centrifugrör </td><td> BD Biosciences </td><td> 352.098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><sTrong&gt; Utrustning </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom Bioscience </td><td> Cellometer Vision </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legend RT Centrifug </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342.975 </td><td></td></tr><tr><td> Kontrollerad hastighet frys </td><td> Rikt </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Bestrålningsanordningen </td><td> CIS bio international </td><td> IBL-437 C # 09.433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Uttryck av molekyler (endogena och Infört) </td></tr><tr><td> Cell Line </td> &lt;td&gt; Common Name </td><td> Celltyp </td><td> Molekyler Uttryckt </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Klon 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP samuttryckt med membranbunden IL-15 </td></tr></tbody></table> Kompletta Odlingsmedier (CCM) (lagrades vid 4 ° C i upp till 30 dagar) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1% glutamax Flödescytometri Buffer (lagrad vid 4 ° C i upp till 30 dagar) PBS 2% FBS 0,1% natriumazid </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

Potensen av kliniska-grade T-celler kan förbättras genom att kombinera genterapi med immunterapi att konstruera en biologisk produkt med potential för överlägsen (i) erkännande av tumörassocierade antigener (TAA), (ii) beständighet efter infusion, (iii) potential för migrering till tumörställen, och (iv) förmåga att återvinna effektorfunktioner i tumören mikromiljön. De flesta metoder för genetisk manipulation av T-celler konstruerade för tillämpning på människor har använt retrovirus och lentivirus för stabilt uttryck av CAR 1-3. Detta tillvägagångssätt, men följer gällande god tillverkningssed (GMP), kan bli dyrt eftersom det bygger på tillverkning och utsläpp av klinisk kvalitet rekombinant virus från ett begränsat antal produktionsanläggningar. Den elektro-överföring av icke-virala plasmider är en tilltalande alternativ till transduktion eftersom DNA arter kan produceras till klinisk kvalitet vid ca 1/10: e kostnaden för recombinant GMP-kvalitet viruset. För att effektivisera integrationen vi anpassade för användning på människa 4-8 Törnrosa (SB) transposon och transposas. Vårt SB systemet använder två DNA-plasmider som består av en transposon som kodar för en gen av intresse (t.ex. 2: a generationens CD19-specifik CAR transgen betecknad CD19RCD28) och ett transposas (t.ex. SB11) som infogar transgenen till TA dinukleotid upprepar 9-11 . För att generera kliniskt tillräckligt antal genetiskt modifierade T-celler som vi använder K562-härledda artificiella antigenpresenterande celler (AAPC) (klon # 4) modifierade för att uttrycka en TAA (t.ex. CD19) samt T-cell molekylerna samstimulerande CD86, CD137L, en membranbundna versionen av interleukin (IL) -15 (peptid fuserad till modifierade lgG4 Fc-region) och CD64 (Fc-γ-receptor 1) för lastning av monoklonala antikroppar (mAb) 12. I denna rapport visar vi de förfaranden som kan utföras i compliance med cGMP att generera CD19-specifik CAR + T-celler som är lämpliga för användning på människa. Detta uppnåddes genom den synkrona elektro-överföring av två DNA-plasmider, en SB transposon (CD19RCD28) och en SB transposas (SB11) följt av återvinning av stabila integranter genom varje-7-dagars tillsatser (stimulering cykel) av γ-bestrålade AAPC (klon # 4) i närvaro av löslig rekombinant humant IL-2 och IL-21 13. Typiskt 4 cykler (28 dagars kontinuerlig odling) genomförs för att generera kliniskt tilltalande antal T-celler som stabilt uttrycker CAR. Denna metod för tillverkning klinisk-grade CD19-specifika T-celler kan användas för T-celler härledda från perifert blod (PB) eller navelsträngsblod (UCB). Dessutom kan denna metod utnyttjas för att generera T-celler till olika tumörtyper genom att para ihop den särskilda karaktären hos den införda bilen med uttryck av TAA, erkänd av bilen, på AAPC.

Vi rapporterar att elektro-överföring av DNA-plasmider och propagering av T-celler på γ-bestrålade AAPC kan användas för att generera kliniskt tilltalande antal av T-celler härledda från PB och UCB för mänskliga tillämpningar. Dessa genetiskt modifierade T-celler uttrycker en introducerade bil som erkänner TAA CD19, oberoende av MHC. SB-härledda DNA-plasmider för att uttrycka den (i) transposon, en 2: a generationens BIL (CD19RCD28) som signaler genom CD28 och CD3-ε 14, och (ii) transposas, SB11 15, tidigare har beskrivits 13, 16,17 . De plasmider som användes i den aktuella studien framställdes kommersiellt av Waisman Klinisk biomanufacturing Facility (Madison, WI). Den AAPC (klon # 4), som härrör från K562-celler (föräldrarnas linje erhålls från American Type Culture Collection), co-express önskad T-cell samstimulerande molekyler (var introducerade molekyl med 3 90% på cellytan av AAPC)såsom tidigare beskrivits 12. Här visar vi att CD19-specifika T-celler kan genereras från mononukleära celler (MNC) härrörande från PB eller UCB använda SB införlivandet införa CAR följt av tillsats av AAPC att numeriskt expandera de T-celler i en CAR-beroende sätt (fig 1 , 4) 13,18. Tio kyvetter (2x10 7 MNC / kyvett) är elektroporeras för varje mottagare med 15 pg DNA-plasmid (CD19RCD28/pSBSO) som kodar för transposon (CAR) och 5 ng DNA-plasmid (pCMV-SB11) som kodar för transposas (SB11). Antalet kyvetter kan minskas om MNC är begränsande eller skalas tillbaka för laboratoriearbete. Dagen för elektroporation definieras som &quot;dag 0&quot; av stimulering cykel # 1. Som kontroller för flödescytometri och odlingsbetingelser, autologa T-celler är mock elektroporation (utan DNA-plasmid) och numeriskt expanderat på γ-bestrålade AAPC (klon # 4) som hade förinstallerad med OKT3 att tvärbinda CD3 att upprätthålla T-cell spridning. Vi routinely bedöma effektiviteten i elektroöverföring och livskraft T-cellerna dagen efter elektroporering (Figur 2B). Uttrycket av EGFP från kontroll-DNA-plasmid (betecknad pmaxGFP) och bil i detta inledande tidpunkt reflekterar proteinuttryck från integrerad och episomal plasmid. Vanligtvis dagen efter elektroporering mäter vi EGFP uttryck vid ~ 60% och bil uttryck vid ~ 40% (figur 2A) med T cellviabiliteten mellan 40-50%. Rekursiva tillsatser av γ-bestrålade AAPC i närvaro av löslig rekombinant humant IL-2 och IL-21 hämta T-celler som stabilt uttrycker BIL (CD19RCD28). CD3 neg CD56 + NK-celler töms från kulturen med CD56-specifika paramagnetiska pärlor om andelen av dessa NK-celler är ≥ 10% och i synnerhet om andelen CAR uttrycks på T-cellerna är låg. Denna utarmning förhindrar snabba överväxt av NK-celler som interfererar med förmågan hos AAPC att upprätthålla proliferation CAR + T-celler. Ibland, är uttömning av NK-celler från CAR + T-celler genomförts under de senaste två stimuleringscykler, men detta introducerar en förlust av önskade celler på grund av co-expression av CD56 på vissa CAR + T-celler. De T-celler odlades i ett funktionellt slutet system som använder Vue påsar Life kultur förbi dag 14. En del av de genetiskt modifierade och förökas T-celler är vanligtvis frysförvarade dag 14 eller dag 21 (slutet av stimulering cykler # 2 eller # 3) av sam-kultur på AAPC att fungera som en källa till arkivmaterial för framtida analyser och att vara tinade om oförutsedda problem uppstår senare under tillverkningsprocessen. T-celler är vanligtvis skördas på eller omkring dag 28 i kulturen (figur 3) som rutinmässigt uttrycker&gt; 90% bil och är&gt; 80% livskraftiga (figur 2C, D). Vi har tidigare visat att efter fyra veckors samodling på AAPC genomsnittlig fold-expansion av CD3 + T-celler är 19.800 ± 11.313 med CA<html> R + uttryck är 90% ± 7,5 13. Dessa T-celler kryokonserveras och genomgår i processen och släpp tester som informerar om säkerhet och terapeutiska potentialen hos den tillverkade produkten. Släpp tester genomföras i enlighet med kliniska ändringar laboratorium förbättring (CLIA) för att generera ett intyg om analys före infusion i mottagare på kliniska prövningar. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Figur 1. Steg som beskriver processen att elektroporera och sprida CAR + T-celler från PB och UCB. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. Karakterisering av genetiskt modifierade T-celler från PB. (A) Expression av EGFP vid dag 0 av första stimuleringsfas cykeln för att bedöma effektiviteten av genöverföringen. Uttryck av CD19-specifik CAR (CD19RCD28) bedömas genom flödescytometri på CD3 +, CD8 + och CD4 + T-celler vid (B) ca 24 timmar efter elektroporering och (C) 28 dagar efter samodling på AAPC. Liknande uttryck för CAR observerades med UCB-härledda T-celler. (D) Kinetik av Bil uttryck. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Figur 3. Förökning av PB-härledd BIL+ T-celler. Andel numeriska expansion av CD3 + och CAR + T-celler som härrör från PB genom upprepad samtidig kultur på γ-bestrålade AAPC i närvaro av rekombinant humant lösligt IL-2 och IL-21. Uppåt pilar indikerar tillsats av γ-bestrålade AAPC som markerar början av varje stimulering cykel. UCB-härledd CAR + T-celler uppvisar likartade frekvenser av numerisk expansion. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Figur 4. Schematisk av tillverkningsprocessen med SB och AAPC system att genetiskt modifiera och utbreda CAR + var T-celler härledda från PB och UCB. CD19-specifik CAR + T-celler som genereras av elektro-överföring av SB-härledda supertvinnade DNA-plasmider och efterföljande samodling på K562-härledd AAPC (klon # 4) i närvaro of rekombinant humant lösligt IL-2 och IL-21. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> T-cellkälla </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposas </td><td width="26"> T-cell infusion </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Autologa (patienten härledd) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Efter autolog hematopoetisk stamcellstransplantation </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14.193 </td></tr><tr><td> Allogen (donator-härledda) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14.577 </td></tr><tr><td> Allogen (donator-härledda) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Efter allogen navelsträngsblod transplantation </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14.739 </td></tr></tbody></table> * Tabell 1. Kliniska prövningar under ledning av FDA i MDACC att ingjuta CD19-specifik CAR + T-celler förökas i AAPC. T-celler återges specifika för CD19 genom påtvingad uttryck av SB transposon kodar för en 2: a generationens CAR, utsedd CD19RCD28 att signaler genom CD28 och CD3-ε. ** Trial beskrivs i referens 5.

Watch this Scientific Journal Video about Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood at JoVE

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T-celler som uttrycker en CD19-specifik chimär antigenreceptor (CAR) är infunderas som undersökning behandling av B-cells maligniteter i vår första-i-humana genterapiförsök. Vi beskriver genetisk modifiering av T-celler med användning av<em&gt; Törnrosa</em&gt; (SB) för att införa CD19-specifik CAR och selektiv förökning på designern CD19 + artificiella antigenpresenterande celler.

Klinisk tillämpning av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Konstgjord och antigenpresenterande celler för att genetiskt modifiera T celler från perifert och navelsträngsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-IG Baserat Konstgjord antigenpresenterande celler för effektiv Ex vivo Utbyggnad av mänskliga CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Utbyggnad av Human Peripheral Blood γδ T-celler med hjälp zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Expanderande Cytotoxiska T-lymfocyter från navelsträngsblod att Target cytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, och adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Konstgjord antigenpresenterande cell (AAPC) medierad aktivering och utbyggnad av naturliga mördarceller T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av prekursor B-cell-underuppsättningar från navelsträngsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generering av Human Alloantigen-specifika T-celler från perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Utveckling av ett antigen-driven kolit modell för att studera Presentation av antigener genom antigenpresenterande celler till T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Mycket multiplexerad, superupplösning av T-celler med hjälp av madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyt differentiering och trombocytantal Formation från mänskliga sladd blod-derived CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...