Name: staphylococcus aureus growth using human hemoglobin as an iron source
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00
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Esta investigación fue apoyada por los EE.UU. Servicio de Salud Pública de subvenciones AI69233 y AI073843 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. EPS es un compañero Burroughs Wellcome en la patogénesis de las enfermedades infecciosas. KPH fue financiado por el Celular y Molecular Microbiología Programa de Entrenamiento de subvención T32 5 A107611-10.

1. La purificación de la hemoglobina de la sangre fresca <ol><li> Adquirir sangre humana fresca suplementada con un anticoagulante. Mantener la sangre en hielo oa 4 ° C durante toda la purificación. </li><li> Centrifugar la sangre durante 20 min a 1.500 x g. Los glóbulos rojos (GR) será en la parte inferior del tubo. Aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender el sedimento suavemente en helado 0,9% (w / v) de solución de NaCl. Repetir la centrifugación y lavar 3 veces. </li><li> Resuspender el precipitado...

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	<li>Mazmanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+heme-iron+across+the+envelope+of+Staphylococcus+aureus.">Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus.</a> Science. 299, 906-909 (2003).</li><li>Pishchany, G., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+for+blood:+hemoglobin+as+a+nutrient+source+for+pathogens.">Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens.</a> PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).</li><li>Haley, K. P., Skaar, E. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+weak+protein-protein+complexes+transfer+heme+across+the+cell+wall+of+Staphylococcus+aureus.">Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).</li><li>Muryoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+the+iron-regulated+surface+determinant+(Isd)+heme+transfer+pathway+in+Staphylococcus+aureus.">Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).</li><li>Reniere, M. L., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+haem+oxygenases+are+differentially+regulated+by+iron+and+haem.">Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem.</a> Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemin+transfer+from+IsdA+to+IsdC+in+the+iron-regulated+surface+determinant+(Isd)+heme+acquisition+system+of+Staphylococcus+aureus.">Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).</li><li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection.">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).</li><li>Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+the+Staphylococcus+aureus+heme+iron+transport+components+IsdA+and+IsdB.">Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB.</a> Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).</li><li>Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+requirements+for+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+persistence+in+host+tissues.">Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues.</a> Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).</li><li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+ions+in+biological+catalysis:+from+enzyme+databases+to+general+principles.">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li><li>Weinberg, E. 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El hierro es un nutriente esencial requerido por los organismos de todos los reinos de la vida 15. En los vertebrados, el hierro es retenido para evitar la toxicidad causada por este elemento. Este secuestro también oculta de hierro de los microbios invasores en un proceso conocido como inmunidad nutricional 16. En respuesta, los patógenos han desarrollado estrategias que evitan la inmunidad nutricional. Uno de estos mecanismos depende de la hemoglobina, que es la fuente más abundante de hierro ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> HPLC columna de intercambio de aniones </td><td> Varian </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo de Drabkin </td><td> Sigma </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> La hemoglobina normal </td><td> Pointe Scientific </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> Chelex 100 sodio forma </td><td> Sigma </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC Standards GmbH </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hemoglobina un anticuerpo </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> SC-21005 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Agar de soja tríptico </td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

staphylococcus aureus growth using human hemoglobin as an iron source

S. aureus es una bacteria patógena que requiere de hierro para llevar a cabo las funciones metabólicas vitales y causan enfermedades. El depósito más abundante de hierro en el interior del huésped humano es heme, que es el cofactor de la hemoglobina. Para adquirir el hierro de la hemoglobina, S. aureus utiliza un complejo sistema conocido como el determinante superficie regulada por hierro (Isd) del sistema 1. Los componentes del sistema Isd primero hemoglobina anfitrión bind, a continuación, extraer e importar hemo, y, finalmente, liberar el hierro del grupo hemo en el citoplasma bacteriano 2,3. Esta vía ha sido diseccionado a través de numerosos estudios in vitro 4-9. Además, la contribución del sistema de Isd a la infección se ha demostrado repetidamente en modelos de ratón 8,10-14. El establecimiento de la contribución del sistema de Isd a la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro y crecimiento ha demostrado ser más difícil. Ensayos de crecimiento usando hemoglobina como única fuente de hierro son complicadas by la inestabilidad de la hemoglobina disponible comercialmente, contaminando hierro libre en el medio de crecimiento, y la toxicidad asociada con quelantes de hierro. Aquí presentamos un método que supera estas limitaciones. Hemoglobina de alta calidad se preparó a partir de sangre fresca y se almacena en nitrógeno líquido. Hemoglobina purificada se completa en hierro-agotan medio que imitan el entorno pobre en hierro encontrada por patógenos dentro del huésped vertebrado. Al privar S. aureus de hierro libre y se completa con una forma mínimamente manipulados de hemoglobina que inducir el crecimiento de una manera que es totalmente dependiente de la capacidad de unirse a la hemoglobina, extraer hemo, heme pasar a través de la envoltura celular bacteriana y degradar hemo en el citoplasma. Este ensayo será útil para los investigadores que buscan para dilucidar los mecanismos de adquisición de hierro hemoglobin-/heme-derived en S. aureus y posiblemente otros patógenos bacterianos.

Hemos purificado hemoglobina humana de hemolizado con HPLC (Protocolo de paso 1,7). Figura 1 muestra registró la absorbancia del eluato a 280 y 410 nm longitud de onda. La fracción 5 se recogió y otras fracciones fueron descartados. Los rendimientos de cinco a quince miligramos de hemoglobina por mililitro de eluato se adquieren. Hemoglobina purificada se analizó por SDS-PAGE por duplicado y los geles se tiñeron para las proteínas o se trasladaron a nitrocelulosa y se inmunotransfirieron (Protocol...

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Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Aquí se describe un ensayo de crecimiento para<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando hemoglobina como la única fuente de hierro nutrientes disponibles. Este ensayo establece el papel de los factores bacterianos implicados en la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro.

Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

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