Name: staphylococcus aureus growth using human hemoglobin as an iron source
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source at JoVE.com

Denna forskning stöddes av US Public bidrag Health Service AI69233 och AI073843 från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar. EPS är en Burroughs Wellcome Fellow i patogenesen av infektionssjukdomar. KPH finansierades av de cellulära och molekylära mikrobiologi Training bidragsprogram 5 T32 A107611-10.

1. Rening av hemoglobin från färskt blod <ol><li> Förvärva färskt humant blod kompletterat med en antikoagulant. Hålla blodet på is eller vid 4 ° C under hela reningen. </li><li> Centrifugera blod under 20 min vid 1.500 x g.. De röda blodkropparna (RBC) kommer att vara vid botten av röret. Försiktigt aspirera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i iskall 0,9% (vikt / volym) NaCl-lösning. Upprepa centrifugering och tvätta 3 gånger. </li><li> Återsuspendera pelleten i 1 volym iskall 10 m...

<ol>
	<li>Mazmanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+heme-iron+across+the+envelope+of+Staphylococcus+aureus.">Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus.</a> Science. 299, 906-909 (2003).</li><li>Pishchany, G., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+for+blood:+hemoglobin+as+a+nutrient+source+for+pathogens.">Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens.</a> PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).</li><li>Haley, K. P., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+battle+for+iron:+host+sequestration+and+Staphylococcus+aureus+acquisition.">A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition.</a> Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).</li><li>Krishna Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+hemoglobin+capture+by+Staphylococcus+aureus+cell-surface+protein.">Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein.</a> IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).</li><li>Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-coordinating+tyrosine+is+a+key+determinant+of+NEAT+domain+heme+transfer.">Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer.</a> Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).</li><li>Villareal, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+weak+protein-protein+complexes+transfer+heme+across+the+cell+wall+of+Staphylococcus+aureus.">Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).</li><li>Muryoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+the+iron-regulated+surface+determinant+(Isd)+heme+transfer+pathway+in+Staphylococcus+aureus.">Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).</li><li>Reniere, M. L., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+haem+oxygenases+are+differentially+regulated+by+iron+and+haem.">Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem.</a> Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemin+transfer+from+IsdA+to+IsdC+in+the+iron-regulated+surface+determinant+(Isd)+heme+acquisition+system+of+Staphylococcus+aureus.">Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).</li><li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection.">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).</li><li>Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+the+Staphylococcus+aureus+heme+iron+transport+components+IsdA+and+IsdB.">Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB.</a> Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).</li><li>Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+IsdB+is+a+hemoglobin+receptor+required+for+heme+iron+utilization.">Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization.</a> J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsdA+and+IsdB+antibodies+protect+mice+against+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+lethal+challenge.">IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge.</a> Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).</li><li>Cheng, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+requirements+for+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+persistence+in+host+tissues.">Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues.</a> Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).</li><li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+ions+in+biological+catalysis:+from+enzyme+databases+to+general+principles.">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li><li>Weinberg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+availability+and+infection.">Iron availability and infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).</li><li>Drabkin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+Hemin+Chromoproteins.">Metabolism of the Hemin Chromoproteins.</a> Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).</li><li>Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD163:+a+signal+receptor+scavenging+haptoglobin-hemoglobin+complexes+from+plasma.">CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 34, 309-314 (2002).</li><li>Torres, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Fur+regulates+the+expression+of+virulence+factors+that+contribute+to+the+pathogenesis+of+pneumonia.">Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia.</a> Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).</li><li>Hammer, N. D., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+of+Staphylococcus+aureus+Iron+Acquisition.">Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition.</a> Annu. Rev. Microbiol. , (2011).</li><li>Hurd, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iron-regulated+surface+proteins+IsdA,+IsdB,+and+IsdH+are+not+required+for+heme+iron+utilization+in+Staphylococcus+aureus.">The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus.</a> Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).</li><li>Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+behavior+of+hemoglobin+alpha-+and+beta-+subunits+during+acid-induced+denaturation+observed+by+electrospray+mass+spectrometry.">Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry.</a> Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).</li><li>Williams, R. C., Tsay, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+chromatographic+method+for+the+preparation+of+human+hemoglobin.">A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin.</a> Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).</li><li>Shen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unmodified+human+adult+hemoglobin+in+Escherichia+coli.">Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).</li><li>Manjula, B. N., Acharya, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+molecular+analysis+of+hemoglobin+by+high-performance+liquid+chromatography.">Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography.</a> Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).</li><li>Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+envelope+proteins+related+to+iron.">Microbial envelope proteins related to iron.</a> Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).</li><li>Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+regulated+outer+membrane+proteins+of+Escherichia+coli:+variations+in+expression+due+to+the+chelator+used+to+restrict+the+availability+of+iron.">Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron.</a> Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).</li><li>Rogers, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-Binding+Catechols+and+Virulence+in+Escherichia+coli.">Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).</li></ol>

Järn är ett viktigt näringsämne som krävs av organismer från alla riken i livet 15. I ryggradsdjur, är järn sekvestreras att undvika toxicitet orsakad av detta element. Denna bindning döljer också järn från invaderande mikrober i en process som kallas näringsmässiga immunitet 16. Som svar har patogener utvecklats strategier som kringgår näringsmässiga immunitet. En sådan mekanism förlitar sig på hemoglobin, vilket är det mest förekommande källan för järn i värden 17.<...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / material </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> HPLC-anjonbytarkolonn </td><td> Varian </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> Drabkin reagens </td><td> Sigma </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> Hemoglobin standard </td><td> Pointe Scientific </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> Chelex 100 natriumform </td><td> Sigma </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC Standards GmbH </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hemoglobin en antikropp </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc. </td><td> SC-21.005 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Tryptic Soy Agar </td><td> BD </td><td> 236.920 </td><td></td></tr></tbody></table>

staphylococcus aureus growth using human hemoglobin as an iron source

S. aureus är en patogen bakterie som kräver järn för att utföra viktiga metaboliska funktioner och orsaka sjukdom. Den vanligast förekommande reservoar av järn i den mänskliga värden är heme, som är kofaktorn av hemoglobin. Att förvärva järn från hemoglobin, S. aureus använder ett avancerat system som kallas järn-reglerade yta determinanten (ISD) systemet 1. Komponenter av investeringstjänstedirektivet systemet först binder värd hemoglobin, sedan extrahera och importera hem, och slutligen frigöra järn från hem i den bakteriella cytoplasman 2,3. Denna väg har dissekerats genom många in vitro-studier 4-9. Vidare har bidrag Isd systemet för infektion upprepade gånger visats i musmodeller 8,10-14. Inrättande av bidrag Isd systemet till hemoglobin-härledda järn förvärv och tillväxt har visat sig vara mer utmanande. Tillväxt-analyser med hjälp av hemoglobin som enda järn källa är komplicerade By instabilitet kommersiellt tillgängliga hemoglobin, kontaminerande fritt järn i tillväxtmediet, och toxicitet associerad med järnkelatorer. Här presenterar vi en metod som övervinner dessa begränsningar. Hög kvalitet hemoglobin framställes från färskt blod och lagras i flytande kväve. Renat hemoglobin kompletteras i järn-bryter medel härma järn-dålig miljö möter patogener inuti vertebratvärden. Genom att svälta S. aureus av fritt järn och komplettera med ett minimalt manipulerad form av hemoglobin som vi framkalla tillväxt på ett sätt som är helt beroende av förmågan att binda hemoglobin, extrahera hem, passera hem genom den bakteriella cellen kuvertet och försämra hem i cytoplasman. Denna analys kommer att vara användbart för forskare som vill klarlägga de hemoglobin-/heme-derived järn förvärv i S. aureus och eventuellt andra bakteriella patogener.

Vi har renat humant hemoglobin från hemolysat med HPLC (protokoll steg 1,7). Figur 1 visar inspelade absorbans av eluatet vid 280 och 410 nm våglängd. Fraktion 5 uppsamlades och andra fraktioner kastades. Utbyten av 5-15 milligram hemoglobin per milliliter eluat typiskt förvärvas. Renat hemoglobin analyserades genom SDS-PAGE i duplikat och gelerna färgades antingen för proteiner eller överfördes till nitrocellulosa och immunoblottades (protokoll steg 1,10, figur 2). <p clas...

Watch this Scientific Journal Video about Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source at JoVE.com

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Här beskriver vi en tillväxt-analys för<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Använda hemoglobin som den enda källan av tillgängligt näringsämnen järn. Denna analys fastställer rollen av bakteriella faktorer som i hemoglobin-härledd järn förvärv.

Staphylococcus aureus Tillväxt med humant hemoglobin som järnkälla

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Användning av Drip Flow och roterande reaktorer Disk för Staphylococcus aureus Biofilm Analys

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subkutan Infektion med meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Kostnadseffektiv metod för mikrobiell källa Spårning med specifika människors och djurs virus

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimentell Endokardit Modell av Meticillinresistenta<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) i råtta

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR-analys f

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studera Interaktioner av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrofiler genom flödescytometri-och Time Lapse Mikroskopi

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Inriktnings Biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Använda Resazurin baserade läkemedlet-känslighet analys

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypning av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; vid Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Metodik för studier av horisontell genöverföring i<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

En musmodell att bedöma medfödda immunsvaret mot Staphylococcus aureus -infektion

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...