Name: isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle
Uploaded: 2013-03-22T12:00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Sarah Dick for å gi kritisk lesing og kommentarer. MAR holder Canada Research Chair i molekylær genetikk, og er en International Research Scholar av Howard Hughes Medical Institute. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til MAR fra National Institutes of Health, Howard Hughes Medical Institute, den kanadiske Institutes of Health Research, muskeldystrofi Association og Canada Research Chair Program.

Alle forsøk ble håndtert i henhold til University of Ottawa regelverk for dyr omsorg og behandling. Se tabell 1 for en oversikt over protokollen. 1. Før du starter Isolation <ol><li> Forbered følgende løsninger: 0,2% kollagenase type I i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium, høy glukose, L-glutamin med 110 mg / ml natrium pyruvat). For to EDL muskler forberede 2 ml 0,2% Collagenease i DMEM. Filtrer løsningen gjennom 0,22 um filter. 10 min før isolasjon, prewarm ved 37 ° C i et vannbad. Ytterligere alikvoter av ufortynnet kollagenase kan fryses ved -20 ° C for senere bruk. MERK: Bruk DMEM med natrium pyruvat i hele prosedyren. Fibre ikke overleve i natrium pyruvat-fri medium. <ul><li> Vaske medier (bruke til å utføre alle de vasker). Supplement DMEM med 1% penicillin / streptomycin. Filtrere gjennom 00,22 mikrometer filter før bruk. </li><li> Myofiber kultur media. Supplere DMEM med 20% FBS, 1% kylling embryo ekstrakt og 1% Penicillin / streptomycin. Filtrer gjennom 0,22 um filter før bruk. </li><li> Matrigel belagt retter. Til kultur fibre for lang tid, anbefaler vi at du bruker Matrigel som belegg substrat. For å forberede Matrigel belagte retter, tine en delmengde av Matrigel ved 4 ° C over natten. Dagen etter, fortynne Matrigel 1:10 i DMEM. Hold Matrigel ved 4 ° C til alle tider og unngå brå temperaturendringer som dette vil skape mikroskopiske krystaller innenfor Matrigel løsningen resulterer i ujevn belegg. Sted retter å være belagt på is. Coat retter med akkurat nok volum til å dekke overflaten. La den sitte i 1 min. Helt fjerne leftover Matrigel. La retter tørke ved 37 ° C i minst 3 timer før bruk eller over natten. </li></ul> Merk: alikvoter av fortynnet Matrigel kan gjenbrukes flere ganger for belegg formål hvis de oppbevares ved 4 &amp; deg; C. </li><li> Til slutt, sørg for å rengjøre mikroskop stasjonen og dissekere verktøy med 70% etanol. </li><li> For to EDL isoleringer (en mus) forberede fem plast petriskåler (60 * 15mm) som følger: <ul><li> Fire retter for isolering (1 for muskel dissosiasjon, 3 for serielle vasker). Alle rettene må være belagt med hest serum (HS) for å hindre myofibers fra fester til plast. Til pels, til pipette 3 ml av hest serum i hver tallerken, virvel tillate enda belegg, fjerne hesten serum og la retten tørke i minst 30 min. Tilsett 4 ml DMEM til hver tallerken. Hold retter ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator før bruk. </li></ul> Merk: Horse serum kan brukes på nytt flere ganger, hvis holdt steril. Alternativt kan en oppløsning av 10% HS i DMEM brukes til å belegge retter. Bruk HS belagt retter gjennom hele protokollen og når dyrking myofibers på flytende betingelser. <ul><li> En tallerken vil bli brukt til kultur myofibers etter isolasjon. Alternative dish størrelser eller formater kan benyttes for den endelige kulturen myofibers avhengig nedstrøms applikasjoner. Men vi ikke foreslå parabolen størrelser større enn 60 * 15mm. Myofibers kan holdes i suspensjon ikke lenger enn 96 timer før hyper sammentrekning oppstår. For lengre kultur ganger, anbefaler vi at du bruker Matrigel belagt retter eller plater. </li></ul></li><li> For en fiber isolasjon (2 EDL), forberede to sterile Pasteur pipetter: en stor boring pipette for muskel håndtering og en liten bar pipette for myofiber manipulasjon. Bruk en diamant penn å kutte hvert glass pipette til ønsket lengde og varme polish å glatte pipette kanter. Ved å bruke flamme, kurve tuppen av liten boring pipette. Dette vil bidra til å håndtere enkle fibre. Flame å sterilisere. Coat hver pipette med HS før bruk. </li></ol> 2. Muskel Dissection og fordøyelse <ol><li> For hensikten med disse eksperimentene, 8 uke gamle SV129, Pax7 Creer Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) og Myf5-Cre; Rosa26YFP ble brukt. </li><li> Spray baklemmene med 70% etanol. Pin dyret (forsiden opp) til en støtte styret å ha en bedre forståelse av den hind lem under prosedyren. </li><li> Med hjelp av saks, skjære gjennom hele lengden av lem og eksponerer det underliggende muskel. Fjern skinnet, samt noen hår eller pels (figur 1A). </li><li> Med en fin saks, skjære gjennom den tynne fascia uten å skade den underliggende muskler. Lokalisere EDL. EDL er funnet i fremre kupé av hind lem like under tibialis anterior (TA) muskel. </li><li> Med hjelp av to tang, utsetter de distale sener. </li><li> Skjær distale sener (både TA og EDL) med skarpe Cohann-Vännäs våren saks. </li><li> Med hjelp av tang hold både TA og EDL muskler ved deres sener og delikat trekke musklene opp mot den indre enden. På dette punktet bør du være i stand til å tydelig seEDL muskel like under muskelen. Nå skille EDL fra muskelen ved å trekke de to sener i motsatt retning (figur 1B). Unngå å strekke EDL muskel mens du utfører denne operasjonen, da dette vil skade myofibers. </li><li> Utsett EDL sene. For å bedre visualisere proksimale sene kan det hjelpe på dette punktet for å fjerne muskelen. Det kan også bidra til å kutte av noen bindevevet rundt kneet (figur 1C). </li><li> Skjær den proksimale sene og fjern forsiktig EDL (figur 1D). </li><li> Ved å holde muskelen gjennom sener, overføre det til 2 ml tidligere utarbeidet collagenase løsning. Inkuber ved 37 ° C i et vannbad. NB: For vellykket fiber isolasjon, er det viktig å isolere EDL fra sene til sene slik at myofiber integritet opprettholdes. Trinn 2,3 til 2,9 kan utføres under et disseksjonsmikroskop. Alternativt, ved bruk av en MAGNifying glass kan også hjelpe å ha en bedre oversikt over musklene. </li><li> Gjenta trinn 02.03 til 02.09 for å isolere den andre EDL. Overfør andre EDL i samme rør. Å unngå ujevn fordøyelse, bør isolere andre EDL fullføres ikke mer enn 5 minutter etter den første. Note 1: inkubasjonstid må kanskje justeres avhengig collagenase aktivitet. Lengre eller kortere inkubasjonstid kan være nødvendig, avhengig av størrelse, alder og / eller muskel tilstand (f.eks fibrotiske muskler trenger lengre fordøyelse tid). Merknad 2: Hvis undersøke satellitt celler oppførsel under Quiescence forhold, uro under muskel fordøyelsen tid kan aktivere satellitt celler 10. </li><li> Under fordøyelsen tid, regelmessig sjekke muskel for å unngå over-fordøyelsen. Stopp fordøyelsen når musklene begynner å løsne opp og myofibers er synlige. Å stoppe fordøyelsen, nøye overføre både muskler til en forvarmet petriskål med 4 ml DMEM (dissociatipå parabol). Bruk den store diameteren pipette til å utføre denne operasjonen. Merk: unngå muskel overdigestion som dette nødvendigvis resulterer i isolasjon av hyper innleide myofibers. </li></ol> 3. Enkelt Myofiber Dissosiasjon og kultur <ol><li> Å frigjøre myofibers, brukes den store boringen glass pipette for å skylle muskel med varm medium til fiber naturlig start blir utgitt. Ikke triturate muskelen som dette vil uunngåelig føre til skadelige fibre. Utføre denne og følgende trinn under et disseksjonsmikroskop. </li><li> Fortsett slippe myofibers til ønsket antall er nådd. Hvis parabolen kreves ved romtemperatur i mer enn 10 min tillate en 5 min (minimum) inkubering ved 37 ° C, 5% CO 2 å re-likevekt mediet. Merk: Hvis medium når temperaturer under fysiologiske (37 ° C) i en lengre periode myofibers vil dø. </li><li> Bruke den lille størrelsen boringen pipette, transfer leve enkelt myofibers til en ny forvarmet tallerken (første av tre etterfølgende vasker). Håndtere hver myofiber enkeltvis i stedet for å overføre hoveddelen av myofibers på en gang. Om nødvendig, Inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2 i 10-15 min for å re-likevekt mediet. </li><li> Gjenta trinn 3.3 for 2 flere ganger eller til alle døde myofibers og rusk er fjernet. Vi anbefaler minst tre påfølgende vasker for riktig rydde opp. Merk: dead myofibers vises som kort og hyper kontrakt under mikroskopet lys. </li><li> Inkuber enkle myofibers ved 37 ° C, 5% CO 2 i den siste vask parabolen (DMEM bare) for minst en time før bytte til kulturmedium. Dette tillater myofibers å justere til in vitro betingelser i fravær av serum. Vi fant ut at umiddelbar kultur myofibers i serum rik medium øker fiber krymper. </li><li> Etter en time, overføre myofibers i nytt forvarmet parabolen eller til den aktuelle kultur formatetavhengig nedstrøms søknaden. Kultur fibre i høy serummedium å tillate satellitt celleaktivering. Alternativt kan forskjellige konsentrasjoner av serum eller kylling embryo ekstrakt også brukes. Endre medium annenhver dag. </li></ol> 4. Nedstrøms Applications <ol><li> Farging. Levende myofibers kan repareres og farget på noe tidspunkt i løpet av isolasjon. Immunfluorescens kan utføres på både flytende og underlag-attached myofibers. Hvis flekker flytende myofibers, bruk en liten boring glass pipette til å overføre myofibers fra en løsning til en annen. Alternativt er det mulig å holde myofibers i samme brønn i hele prosedyren og legge til / fjerne løsninger bruk av en glass pipette. Unngå standard aspirasjon da dette vil resultere i fjerning av myofibers også. Kort, fjerne dyrkningsmedium; fix myofibers i forvarmet 4% paraformaldehyd (PFA) i 5 min. Omfattende vask i PBS flere ganger. Incubate myofibers i 1% glysin i PBS eller andre standard slukke løsninger for å minimere PFA bakgrunnsfarging. Om nødvendig, permeabilize myofibers med 0,1% Triton X-100 i PBS i 10 minutter etterfulgt av en 5 min vask i PBS. Inkuber fibre i blokkering løsning (10% hest serum, 0,1% Triton X-100, 1% NaN) i 1 time ved romtemperatur eller fortrinnsvis over natten ved 4 ° C. Alternative blokkerende løsninger kan brukes, avhengig av antistoffet av interesse. Vask en gang i PBS i 5 min. Inkuber med riktig primære antistoff fortynnet i blokkering løsning i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C. Vask fibre 3 ganger med 5 min per vask i PBS for å fjerne eventuelle ubundet antistoff. Inkuber med riktig sekundært antistoff i 45 minutter til 1 time ved romtemperatur. Vask 3 ganger på 5 min per vask i PBS. Counterstain atomkjerner med 1 mg / ml DAPI. Hvis flekker flytende fibre, overføre hver fiber til en glass-slide egnet for mikroskopi. Fjern overflødig PBS eller medium. Påfør montering medium og deretter legge dekkglass. Fortsett å visualisere myofibers under et fluorescens mikroskop. Se figur 4 for representative immunfluorescens på EDL myofibers. Alternative flekker prosedyrer ved hjelp sterkere fiksativer er beskrevet i Verma, M. et al. 11 og Wosniak, AC et al. 12. </li><li> Oligonukleotid eller plasmid forbigående transfeksjon. Levende myofibers kan transfektert med plasmid eller siRNA for spesifikt gen / s av interesse. Når du bruker siRNA er dobbelt transfeksjon anbefales for effektiv gene knockdown. Vi anbefaler at det første transfeksjon etter 8 timers fra isolasjon. Seks timer etter transfeksjon, erstatte med friskt medium. For siRNA transfeksjon, foreslår vi å starte ved hjelp av en endelig konsentrasjon på 50 nM. Genuttrykk knockdown kan analyseres ved RNA ekstraksjon eller fortrinnsvis ved farging. </li><li> Virusinfeksjon. Infeksjon av levende myofibers er mulig selv om forekomsten av cellendøden er høyere enn med oligo transfeksjon og effektiviteten av infeksjon kan være variabel avhengig av muskel forhold og alder. For eksempel, intakte voksne muskel myofibers er spesielt ikke responsive til virusinfeksjon på grunn av tilstedeværelsen av den basale lamina som har vist seg å gi en beskyttende barriere mot vert 13 infeksjon, 14. Lentiviral vektorer er å foretrekke fremfor retrovirale vektorer fordi de kan infisere hvilende (ikke mitotiske) celler. For viral infeksjon, er det tilrådelig å kultur fiber på en Matrigel belagt parabolen eller plate og la myofibers tilpasse seg media vilkår for de første 24 hr. </li><li> Lever Imaging. Sanntidsavbildning av myofibers er spesielt tidkrevende og nødvendiggjør et mikroskop utstyrt med en 37 ° C, 5% CO 2 kammeret. Det er nyttig ved vurdering av atferd én satellitt celler. Arbeid gjøres ved hjelp av denne teknikken har vært avgjørende for oppdagelsen av satellitt celle heterogenitet og å studere deres Behavior på fibre (15 og 16). </li></ol>

<ol>
	<li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+muscle+satellite+cells+on+intact+myofibers+in+culture.">Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture.</a> Dev. Biol. 115 (1), 129-139 (1986).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Misunoya, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+muscle+fiber+isolation+and+culture+for+cellular+molecular,+pharmacological,+and+evolutionary+studies.">Single muscle fiber isolation and culture for cellular molecular, pharmacological, and evolutionary studies.</a> Methods Mol. Biol. 798, 85-102 (2012).</li><li>Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods Mol. Biol. 290, 281-304 (2005).</li><li>White, R. B., Bi&#233;rinx, A. S., Gnocchi, V. F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+muscle+fibre+growth+during+postnatal+mouse+development.">Dynamics of muscle fibre growth during postnatal mouse development.</a> BMC Developmental Biology. 10 (21), 1-11 (2010).</li><li>Siegel, A. L., Kuhlmann, P. K., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cell+proliferation+and+association:+new+insights+from+myofiber+time-lapse+imaging.">Muscle satellite cell proliferation and association: new insights from myofiber time-lapse imaging.</a> Skeletal Muscle. 2 (1), 1-7 (2011).</li><li>Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+muscle+stem+cells+by+fluorescence+activated+cell+sorting+cytometry.">Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 798, 53-64 (2012).</li><li>Engler, A. D., Griffin, M. A., Sen, S., Bonnemann, C. G., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubes+differentiate+optimally+on+substrates+with+tissue-like+stiffness:+pathological+implications+for+soft+or+stiff+microenvironments.">Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments.</a> J. Cell. Biol. 166 (4), 877-887 (2004).</li><li>Boonen, K. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+stem+cell+niche:+regulation+of+satellite+cells+during+regeneration.">The muscle stem cell niche: regulation of satellite cells during regeneration.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14 (4), 419-431 (2008).</li><li>Wozniak, A. C., Anderson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fiber+isolation+and+maintenance+of+satellite+cell+quiescence.">Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence.</a> Biochem. Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).</li><li>Verma, M., Asukura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Single+Muscle+Fiber+Isolation+from+Alcohol-Fixed+Adult+Muscle+following+&#946;-Galactosidase+Staining+for+Satellite+Cell+Detection.">Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following &#946;-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 60-67 (2001).</li><li>Wosniak, A. C., Pilipowics, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Met+expression+and+mechanical+activation+of+satellite+cells+on+cultured+muscle+fibers.">C-Met expression and mechanical activation of satellite cells on cultured muscle fibers.</a> J. Histochem. Cytochem. 51 (11), 1437-1445 (2003).</li><li>Huard, J., Feero, W. G., Watkin, S. C., Hoffman, E. P., Rosenblatt, J. D., Glorioso, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basal+lamina+is+a+physical+barrier+to+herpes+simplex+virus-mediated+gene+delivery+to+mature+muscle+fibers.">The basal lamina is a physical barrier to herpes simplex virus-mediated gene delivery to mature muscle fibers.</a> J. Virol. 70 (11), 8117-8123 (1996).</li><li>Feero, W. G., Rosenblatt, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+delivery+to+skeletal+muscle:+insights+on+maturation-dependent+loss+of+fiber+infectivity+for+adenovirus+and+herpes+simplex+type+1+viral+vectors.">Viral gene delivery to skeletal muscle: insights on maturation-dependent loss of fiber infectivity for adenovirus and herpes simplex type 1 viral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 8 (4), 371-380 (1997).</li><li>Kuang, S., Kuroda, K., grand, F. L. e., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+self-renewal+and+commitment+of+satellite+stem+cells+in+muscle.">Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle.</a> Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).</li><li>Siegel, A. L., Atchison, K., Fisher, K. E., Davis, G. E., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+timelapse+analysis+of+muscle+satellite+cell+motility.">3D timelapse analysis of muscle satellite cell motility.</a> Stem Cells. 27 (10), 2527-2538 (2009).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells.">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+adopt+divergent+fates:+a+mechanism+for+self-renewal.">Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal.</a> J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).</li></ol>

Ingen konkurrerende interesser.

Isolering og kultur av enkelt myofibers fra intakte muskler gir en utmerket in vitro modell for å studere prosessen muskelregenerasjonenen. En unik funksjon i dette systemet er bevaring av satellitten celler i deres fysiologiske miljø under basal lamina. Viktigst, kan teknikken brukes til å undersøke muskel stamcelleforskningen atferd både quiescence og aktiverte stater. I løpet av de siste 20 årene har myofiber kultur systemet er levert meningsfulle innsikt i biologi satellitt cellepopulasjon både med hensyn til indre og ytre faktorer. Ved dyrking individuelle myofibers har satellitt celle heterogenitet med hensyn til myofiber, muskel type eller regenerativ potensial blitt adressert 15. Forseggjort studier med direkte avbildning av enkle dyrkede fibre tillatt for å få informasjon om satellitt celle vandringsmønster 16. Kjøpet av kvantitative data er enLSO er mulig. Selv tidkrevende, gir det vesentlig informasjon om utbredelse og forekomst av spesifikke hendelser (stamceller asymmetrisk divisjon, spredning og differensiering ratio, etc.). Sammen med tidligere beskrevne anvendelser, er protein eller RNA ekstraksjon fra enkle fibre også mulig, selv om isolasjon av ren populasjon av satellitten celler etter FACS eller andre midler kan gi en bedre plattform å undersøke protein eller genekspresjon endringer på et molekylært nivå. I vår erfaring, er det mest kritiske trinnet for vellykket fiber isolert &quot;sene til sene&quot; isolasjon (trinn 2.5 til 2.9 i protokollen tekst). Dette garanterer at etter muskel fordøyelsen, er fiber frigjøres fra EDL med minimal eller ingen skade og dermed øke sine resultater i de neste trinnene.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens / Material </td></tr><tr><td> Kollagenase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Forbered ferske alle tider for optimale resultater. Ytterligere alikvoter av ufortynnet kollagenase kan lagres ved -20 ° C. </td></tr><tr><td> DMEM Høy Glukose + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Tilsetting av Pen / Strep er nødvendig for å minimere luftforurensning </td></tr><tr><td> Preget Fetal Bovine Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lot # KUJ35152 </td></tr><tr><td> Hest Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lot # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Kylling Embryo Extract </td><td> Nøyaktig Chemical </td><td> CE-650-T, Batch B7035010 </td><td> Unngå frysing-tining sykluser. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> Oppbevar alikvoter ved -20 ° C. Unngå frysing-tining sykluser. Lagre utvannet aliquoter ved 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utstyr </td></tr><tr><td> Cohann-Vännäs Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra Tynn Iris saks-10.5cm </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Iris tang Curved </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur Pipettes </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Diamond Pen </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm Petri Dish </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0,22 mikrometer filter </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Disseksjonsmikroskop StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> En ekstra lyskilde kan bli pålagt å ha et bedre fokus visning </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

Muskelregenerasjonenen i voksen er utført av fastboende stamceller kalt satellitt celler. Satellitt celler er definert av sin posisjon mellom basal lamina og sarcolemma av hver myofiber. Dagens kunnskap om deres atferd er sterkt avhengig av bruken av singelen myofiber isolasjon protokollen. I 1985 beskrev Bischoff en protokoll for å isolere én levende fibre fra Flexor digitorum Brevis (FDB) av voksne rotter med det mål å skape et in vitro system der den fysiske tilknytningen mellom myofiber og dets stamceller er bevart en. I 1995 Rosenblattmodified den Bischoff protokollen slik at myofibers er enkeltvis plukket og håndtert separat etter collagenase fordøyelsen stedet for å bli isolert av tyngdekraften sedimentering 2, 3. Den Rosenblatt eller Bischoff protokollen har siden blitt tilpasset ulike muskler, alder eller forhold 3-6. Singelen myofiber isolasjon teknikk er en uunnværligverktøy på grunn av sin unike fordeler. Først i den ene myofiber protokollen, er satellitt celler opprettholdes under basal lamina. Dette er en unik funksjon av protokollen som andre teknikker som Fluorescence Aktivert Cell Sortering krever kjemisk og mekanisk vev dissosiasjon 7. Selv om myofiber kultur systemet ikke kan erstatte in vivo studier, det tilbyr en utmerket plattform for å løse relevante biologiske egenskaper av muskel stamceller. Enkelt myofibers kan dyrkes i standard plating forhold eller i flytende forhold. Satellitt celler på flytende myofibers er utsatt for nesten ingen annen innflytelse enn myofiber miljøet. Substrat stivhet og belegg har vist seg å påvirke satellitt cellenes evne til å regenerere muskler 8, 9 så å kunne kontrollere hver av disse faktorene tillater uavhengig diskriminering mellom nisje-avhengig og-uavhengige responser. Ulike konsentrasjoner av serum harogså vist seg å ha en effekt på overgangen fra quiescence til aktivering. Å bevare quiescence tilstanden av dens tilknyttede satellitt celler, bør fibrene holdes i lav serummedium 1-3. Dette er spesielt nyttig når man vil studere gener involvert i quiescence staten. I serum rik medium, satellitt celler raskt aktivere, spre seg, migrere og skille, og dermed etterligne in vivo regenerativ prosess 1-3. Systemet kan brukes til å utføre en rekke analyser som testing av kjemiske inhibitorer; ektopisk ekspresjon av gener ved virus produksjonstid; oligonukleotid basert genet knock-ned eller direkte avbildning. Denne videoen artikkelen beskriver protokollen som nå brukes i vårt laboratorium for å isolere én myofibers fra extensor digitorum longus (EDL) muskel av voksne mus (6-8 uker gamle).

Her har vi beskrevet isolasjon av enkle myofibers fra EDL muskel av voksne mus. Vellykket myofibers gi avhenge av flere faktorer, som for eksempel collagenase aktivitet eller muskel forhold eller alder. Viktigst, viser isolasjon av muskel fra sene til sene resulterer i lange, intakte myofibers fra EDL muskel. Figur 1 en trinnvis grafisk representasjon av &quot;sene til sene&quot; isolasjon. Når muskelen er fullt fordøyd, myofibers utgitt ved å trykke lett på muskelen. Figur 2A viser et representativt bilde av en myofiber isolasjon eksperimentet etter første vask. På dette punktet kulturen inneholder en blanding av bunter av enkle myofibers som vises som lange og skinnende rørformede strukturer, kontrakt hyper myofibers som er mørk og kort og rusk fra fordøyelsen. Ved utgangen av minst tre påfølgende vask, bør bare enkle levende myofibers forbli i dish for kultur eller nedstrøms analyse (figur 2B). Fig. 2C viser en lang, live fiber i forhold til en hyper kontrahert fiber (C &#39;). På tidspunktet for isoleringen, satellitt celler vises som bittesmå fremspring på myofiber overflaten (figur 3A). Hvis opprettholdt i serum rik medium, satellitt celler aktivere spre seg, migrere og til slutt smelte inn myotubes (B). Etter 15 dager i kultur, alle myotubes uttrykker Myf5 reporter YFP (C) som tyder på at muskelregenerasjonenen i voksen utføres av celler som på et tidspunkt i løpet av sin utvikling hadde uttrykt myogenic determinant faktor Myf5. Alle satellitt celler uttrykker den sammenkoblede boksen transkripsjonsfaktor Pax7 17. Reporteren mus linje Pax7Cre-TdTomato kan brukes til å spore satellitt celler via ekspresjon av TdTomato fluorescenssignalet (Tall 3D og E). Fig. 4 viser et representativt immunologiskenofluorescence av dobbel Pax7 + / Myod satellitt celler. Klassisk double Pax7 + / Myod + satellitt celler anses proliferative engasjerte muskel forfedre som enten fullføre differensiering programmet ved ned regulere Pax7 samtidig opprettholde Myod uttrykk eller tilbake til quiescence ved ned regulere Myod og opprettholde Pax7 uttrykk 18 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. EDL muskel isolasjon fra mus hindlimb. A. Hindlimb av en 8 ukers gammel voksen mus. Piler angir den distale (kne) sene og den proksimale (foten) sene. B. Anatomisk posisjon tibialis anterior (TA) muskel og extensor digitorum longus (EDL) muskel. C. Ved å holde EDL gjennom proksimale senen, er muskelen trukket mot kneet å eksponere den distale sene. D. Den distale sene erklipp og EDL er utgitt. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Representative resultater av en enkelt myofiber isolasjon eksperiment. A. Mørkefelt bilde av en myofiber isolasjon eksperiment ved første vasketrinn. Rød pil indikerer levende myofibers, indikerer hvit pil hyper innleide myofibers og gule pilen viser celler, myofiber eller ECM rusk. B. Etter påfølgende vasker i DMEM, bare levende myofibers gjenstår. C og C &#39;. Bildet representerer en lang intakt levende myofiber (C) og en kort hyper kontrakt myofiber (C &#39;). Bar 10 mm. Bildene ble tatt med en Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop utstyrt med AxioCam HR. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur<html> e 3. Representative resultater av en enkelt myofiber kultur eksperiment. A. Mørkefelt bilde av en enkelt, levende myofiber med tilhørende satellitt celle (pil) rett etter isolasjon (Tid 0). B. Enkle myofibers ble platet på Matrigel og dyrket i serum rik medium i 15 dager. Hvit pil viser differensierte myotubes i forhold til enkeltceller (gul pil) C. Enkelt myofibers fra en Myf5Cre, RosaYFP mus ble dyrket som i B. Pil viser Myf5 avledede myotubes. D og E. Enkeltrom myofibers fra Pax7Cre, TdTomato ble isolert og løst rett etter. Pilene angir Pax7 positive quiescent satellitt celle (E, red). Atomkjerner ble kontrafarget med DAPI (D). Bar: 50 mikrometer. Bildene ble tatt med en Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop utstyrt med AxioCam HR. måter &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Figur 4"/> Figur 4. Eksempel på immunfluorescens farging av satellitten celler på myofibers. Enkelt myofibers ble isolert og dyrket i 72 timer i flytende forhold. Satellitt celler på myofibers ble farget for satellitt celle spesifikk markør Pax7 (B, rød) og myogenic regulerende faktor Myod (C, grønn). Atomkjerner ble kontrafarget med DAPI (A). Barer: 50 mikrometer. Bildene ble tatt med en Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop utstyrt med AxioCam HR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Muscle Dissection (5 min hver muskel) </td><td><ul><li> Sene til sene isolasjon </li><li> Skarpe redskaper </li><li> Minimal muskelskade </li></ul></td></tr><tr><td> Muscle Fordøyelse (30-45 min) </td><td><ul><li> Temperatursensitive </li><li> Unngå overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber isolasjon </td><td><ul><li> Unngå manipulering av fibre </li><li> Eliminere avfall med flere vasker </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber Kultur (opptil 3-4 uker) </td><td><ul><li> Format: enhver </li><li> Belegg: hest serum, Matrigel </li><li> Medium: basal eller høy serum </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Oversikt over myofiber isolasjon protokollen. Den myofiber isolasjon protokollen består av 4 store skritt. For hvert trinn er omtrentlig tid og store kritiske punkter diskutert. For nærmere omtale av hvert trinn, se protokollen teksten.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle at JoVE.com

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolasjon og kultur myofibers er gullstandarden<em&gt; In vitro</em&gt; For å studere overgangen til satellitt celler gjennom quiescence, aktivering og differensiering. Viktigere, bevarer den eneste myofiber kultur systemet myofiber / stamcelleforskningen forening, som er en viktig del av muskel stamceller nisje.

Isolasjon og kultur av individuelle myofibers og deres satellitt celler fra voksne Skeletal Muscle

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse av Embryonale og Larvesebrafisk Skeletal myofibers fra Dissosierte Forberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolasjon, Kultur, og Transplantasjon av Muscle satellitt celler

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering av Blood-fartøy-avledet multipotent Forstadier fra Menneskelig Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, Isolering og Imaging av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur av primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering og karakterisering av eksosomer fra skjelettmuskulaturfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...