Name: isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle
Uploaded: 2013-03-22T12:00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle at JoVE.com

Vi vill tacka Sarah Dick för att ge kritisk läsning och kommentarer. MAR innehar Kanada forskning ordförande i molekylär genetik och är en internationell forskning Scholar av Howard Hughes Medical Institute. Detta arbete har finansierats med bidrag till Mar från National Institutes of Health, Howard Hughes Medical Institute, den kanadensiska Institutes of Health Research, den muskeldystrofi Association och Kanada forskning ordförande Program.

Alla experiment har hanterats enligt University of Ottawa regler för djuromsorg och hantering. Se tabell 1 för en översikt av protokollet. 1. Innan Starta Isolering <ol><li> Bered följande lösningar: 0,2% Kollagenas typ I i ​​DMEM (Dulbeccos modifierade Eagles medium, hög glukos, L-glutamin med 110 mg / ml natriumpyruvat). För två EDL muskler framställa 2 ml 0,2% Collagenease i DMEM. Filtrera lösningen genom 0,22 pm filter. 10 min före isolering, Förvärm vid 37 ° C i ett vattenbad. Ytterligare alikvoter av outspädd kollagenas kan frysas vid -20 ° C för senare användning. OBS: använd DMEM med natriumpyruvat i hela förfarandet. Fibrer överlever inte i natriumpyruvat-fritt medium. <ul><li> Tvätt medier (använda för att utföra alla de tvättar). Supplement DMEM med 1% penicillin / streptomycin. Filtrera genom 00,22 pm filter före användning. </li><li> Myofiber odlingsmedier. Supplement DMEM med 20% FBS, 1% kycklingembryo-extrakt och 1% penicillin / streptomycin. Filtrera genom 0,22 um filter före användning. </li><li> Matrigel belagda skålar. Till kultur fibrer för lång tid, rekommenderar vi att du använder Matrigel som beläggning substrat. För att framställa Matrigel belagda skålar, tina en alikvot av Matrigel vid 4 ° C över natten. Dagen efter, späd Matrigel 1:10 i DMEM. Håll Matrigel vid 4 ° C vid alla tidpunkter och undvika plötsliga temperaturförändringar eftersom detta kommer att skapa mikroskopiska kristaller i Matrigel lösningen resulterar i ojämn beläggning. Placera rätter som skall beläggas på is. Coat rätter med bara tillräckligt volym för att täcka ytan. Låt det sitta i 1 minut. Helt ta bort överblivna Matrigel. Låt disken torkar vid 37 ° C under minst 3 timmar före användning eller över natten. </li></ul> Obs: alikvoter av utspädd Matrigel kan återanvändas flera gånger för beläggning ändamål om den förvaras vid 4 &amp; deg, C. </li><li> Slutligen, se till att rengöra mikroskop station och dissekera verktyg med 70% etanol. </li><li> För två EDL isoleringar (en mus) förbereda fem petriskålar av plast (60 * 15mm) enligt följande: <ul><li> Fyra rätter för isolering (1 för muskel dissociation, 3 för seriell tvättar). Alla rätter måste beläggas med hästserum (HS) för att förhindra myofibers från att fästa till plast. Att belägga, till pipett 3 ml hästserum i varje skål, virvel tillåta jämn beläggning, bort hästserum och låt skålen torka under minst 30 minuter. Tillsätt 4 ml DMEM till varje skål. Håll rätter vid 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator före användning. </li></ul> Obs: Häst-serum kan återanvändas flera gånger, om den förvaras sterilt. Alternativt kan en lösning av 10% HS i DMEM användas för att belägga rätter. Använd HS belagda rätter hela protokollet och vid odling myofibers på flytande tillstånd. <ul><li> En maträtt kommer att användas för att odla myofibers efter isoleringen. Alternative maträtt storlekar eller format kan användas för den slutliga kultur myofibers beroende på nedströms tillämpningar. Däremot föreslår vi inte maträtt som är större än 60 * 15mm. Myofibers kan hållas i suspension under längre tid än 96 timmar innan hyper kontraktion inträffar. För längre kultur gånger rekommenderar vi att du använder Matrigel belagda rätter eller plattor. </li></ul></li><li> För en fiber isolering (2 EDL), förbereda två sterila Pasteur pipetter: en stor borrning pipett för muskel hantering och en liten borrning pipett för myofiber manipulation. Använd en diamant penna för att skära varje glaspipett till önskad längd och värme polska att utjämna pipett kanter. Genom att använda lågan, kurvan spetsen av den lilla borrningen pipetten. Detta kommer att bidra hantera enstaka fibrer. Flamman att sterilisera. Belägga varje pipett med HS före användning. </li></ol> 2. Muscle Dissektion och matsmältning <ol><li> För att dessa experiment 8 veckor gamla SV129, Pax7 Creer Cklr, Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) och Myf5-Cre, Rosa26YFP användes. </li><li> Spraya bakben med 70% etanol. Nåla djuret (uppåt) till en bärare styrelsen att ha en bättre grepp om bakbenet under förfarandet. </li><li> Med hjälp av sax, skära genom hela längden av lemmen och exponera den underliggande muskeln. Ta bort skinnet liksom varje hår eller päls (Figur 1A). </li><li> Med en fin sax, skär igenom den tunna fascia utan att skada underliggande muskler. Visuellt lokalisera EDL. EDL finns i den främre avdelningen av bakbenet precis under tibialis anterior (TA) muskel. </li><li> Med hjälp av två tång, exponera de distala senor. </li><li> Skär de distala senor (av både TA och EDL) med skarpa Cohann-Vännäs våren sax. </li><li> Med hjälp av pincett hålla både TA och EDL muskler av sina senor och noga dra musklerna upp mot den proximala änden. Vid det här laget bör du kunna tydligt seEDL muskeln precis under TA muskeln. Nu separera EDL från TA muskeln genom att dra de två senor i motsatta riktningar (figur 1B). Undvik stretching EDL muskeln när de utför denna operation eftersom det kommer att skada myofibers. </li><li> Exponera EDL senan. Att bättre visualisera den proximala senan det kan hjälpa i detta skede för att ta bort TA muskeln. Det kan också hjälpa till att skära av en del av bindväv runt knät (figur 1C). </li><li> Skär den proximala senan och ta försiktigt bort EDL (figur 1D). </li><li> Genom att hålla muskeln genom dess senor, överför den till 2 ml av tidigare framställda kollagenaslösning. Inkubera vid 37 ° C i ett vattenbad. Anmärkning: för framgångsrik isolering fibrer, är det viktigt att isolera EDL från senan till sena så att myofiber integritet bibehålls. Steg från 2,3 till 2,9 kan utföras under ett dissektionsmikroskop. Alternativt kan användningen av en MAGNifying glas kan också bidra till att få en bättre bild av musklerna. </li><li> Upprepa steg från 2,3 till 2,9 för att isolera den andra EDL. Överför den andra EDL i samma rör. För att undvika ojämn matsmältning, bör isolering av den andra EDL fyllas mer än 5 minuter efter den första. Anmärkning 1: inkubationstid kan behöva justeras beroende på kollagenasaktivitet. Längre eller kortare inkubationstid kan behövas beroende på storlek, ålder och / eller muskler tillstånd (t.ex. fibrotiska muskler behöver längre koktiden). Anm 2: Om undersöka satellit celler beteende under overksamhet förhållanden, agitation under muskel koktiden kan aktivera satellit celler 10. </li><li> Under koktiden, regelbundet kontrollera muskeln för att undvika över-matsmältningen. Stoppa matsmältningen när musklerna börjar slappna av och myofibers är synliga. För att stoppa matsmältningen, töm båda muskler till en förvärmd petriskål med 4 ml DMEM (dissociatipå fat). Använd den stora hålstorlek pipett för att utföra den här åtgärden. Obs: Undvik muskel overdigestion som detta oundvikligen leder till isolering av hyper kontrakterade myofibers. </li></ol> 3. Singel Myofiber dissociation och kultur <ol><li> För att frigöra myofibers, använd det stora hålet glaspipett att spola muskeln med varmt medium tills fibrer naturligt börjar släpps. Undvik triturera inte muskeln eftersom detta oundvikligen leda till skadliga fibrer. Utför denna och de följande stegen under ett dissektionsmikroskop. </li><li> Fortsätt släppa myofibers tills önskat nummer har nåtts. Om skålen erfordras vid rumstemperatur under mer än 10 minuter tillåter en 5 min (minsta) inkubation vid 37 ° C, 5% CO 2 att åter jämvikta mediet. Obs: om mediet når temperaturer under fysiologiska (37 ° C) under en längre tid myofibers kommer att dö. </li><li> Använda små hål pipett, transfer bor enstaka myofibers till en ny förvärmd skål (första av tre på varandra följande tvättar). Hantera varje myofiber individuellt istället för att överföra huvuddelen av myofibers allt på en gång. Om det är nödvändigt, inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 under 10-15 minuter för att åter jämvikta mediet. </li><li> Upprepa steg 3,3 för 2 gånger eller tills alla döda myofibers och skräp tas bort. Vi rekommenderar minst tre på varandra följande tvättar för korrekt sanering. Obs: döda myofibers visas som kort och hyper kontrakterade under mikroskop ljus. </li><li> Inkubera enstaka myofibers vid 37 ° C, 5% CO 2 i den sista tvättningen skålen (DMEM enbart) i minst en timme innan omkoppling till odlingsmediet. Detta tillåter myofibers att anpassa sig till in vitro betingelser i frånvaro av serum. Vi fann att omedelbart kultur myofibers i serum rikt medium ökar fiber krymper. </li><li> Efter en timme, överför myofibers till en ny förvärmd maträtt eller till lämplig kultur-formatetberoende på nedströms ansökan. Kultur fibrer i hög serum-medium för att möjliggöra satellit cellaktivering. Alternativt, kan olika koncentrationer av serum eller kycklingembryo-extrakt även användas. Ändra medelhög varannan dag. </li></ol> 4. Nedströmstillämpningar <ol><li> Immunfärgning. Levande myofibers kan fixeras och färgas vid någon tidpunkt under isoleringen. Immunofluorescens kan utföras på både flytande och substrat-bunden myofibers. Om färgning flytande myofibers, använd en liten hål glaspipett för att överföra myofibers från en lösning till en annan. Alternativt är det möjligt att hålla myofibers i samma brunn över hela förfarandet och lägga till / ta bort lösningar med hjälp av en glaspipett. Undvik standard strävan eftersom detta kommer att resultera i avlägsnandet av myofibers samt. Kortfattat, helt ta bort odlingsmedium; fix myofibers i förvärmd 4% paraformaldehyd (PFA) under 5 min. Omfattande tvätta i PBS flera gånger. Inkubatorte myofibers i 1% glycin i PBS eller andra standardlösningar quenching för att minimera PFA bakgrundsfärgning. Om nödvändigt, permeabilisering myofibers med 0,1% Triton X-100 i PBS under 10 min följt av en 5 min tvättning i PBS. Inkubera fibrer i blockeringslösning (10% hästserum, 0,1% Triton X-100, 1% NaNs) under 1 timme vid rumstemperatur eller företrädesvis över natten vid 4 ° C. Alternativa blockerande lösningar kan användas, beroende på antikroppen av intresse. Tvätta en gång i PBS under 5 minuter. Inkubera med lämplig primär antikropp utspädd i blockeringslösning under 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C. Tvätta fibrer 3 gånger vid 5 min per tvätt i PBS för att avlägsna eventuell obunden antikropp. Inkubera med lämplig sekundär antikropp under 45 min till 1 h vid rumstemperatur. Tvätta 3 gånger med 5 minuter per tvätt i PBS. Motfärga kärnor med 1 mg / ml DAPI. Om färgning flytande fibrer, överföra varje fiber till en glasskiva som lämpar sig för mikroskopi. Avlägsna eventuellt överskott av PBS eller medium. Ansök montering medium och sedan lägga täckglas. Fortsätt att visualisera myofibers under ett fluorescensmikroskop. Se Figur 4 för representativ immunofluorescens på EDL myofibers. Alternativa färgning förfaranden med användning starkare fixeringsmedel beskrivs i Verma, M. et al. 11 och Wosniak, AC et al. 12. </li><li> Oligonukleotid eller plasmiden transient transfektion. Levande myofibers kan transfekteras med plasmid eller siRNA för specifik gen / s intresse. När du använder siRNA är dubbelt transfektion rekommenderas för effektiv gen knockdown. Vi föreslår utför den första transfektion efter 8 timmar från isoleringen. Sex timmar efter transfektion, ersätta med färskt medium. För siRNA transfektion föreslår vi börjar med en slutlig koncentration av 50 nM. Genuttryck ÖVERVÄLDIGANDE kan analyseras genom RNA-extraktion eller företrädesvis genom immunfärgning. </li><li> Virusinfektion. Infektion av levande myofibers är möjlig trots förekomsten av cellensdöd är högre än med oligo transfektion och effektiviteten av infektion kan vara variabel beroende på muskel förhållanden och ålder. Till exempel, intakta vuxna muskel myofibers är särskilt icke svarar på virusinfektion på grund av närvaron av den basala lamina som har visat sig ge en skyddande barriär mot värd-infektion 13, 14. Lentivirala vektorer är att föredra framför retrovirala vektorer, eftersom de kan infektera vilande (icke mitotiska) celler. För virusinfektion, är det lämpligt att kultur fibrer på en Matrigel belagd maträtt eller tallrik och låt myofibers anpassa sig till media villkor för de första 24 tim. </li><li> Live Imaging. Realtidsundersökningen av myofibers är särskilt tidskrävande och kräver ett mikroskop utrustat med en 37 ° C, 5% CO 2 kammare. Det är användbart vid bedömningen beteende enstaka satellit celler. Arbetet görs med hjälp av denna teknik har varit avgörande för upptäckten av satellit celler heterogenitet och att studera deras betevior på fibrer (15 och 16). </li></ol>

<ol>
	<li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+muscle+satellite+cells+on+intact+myofibers+in+culture.">Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture.</a> Dev. Biol. 115 (1), 129-139 (1986).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Misunoya, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+muscle+fiber+isolation+and+culture+for+cellular+molecular,+pharmacological,+and+evolutionary+studies.">Single muscle fiber isolation and culture for cellular molecular, pharmacological, and evolutionary studies.</a> Methods Mol. Biol. 798, 85-102 (2012).</li><li>Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods Mol. Biol. 290, 281-304 (2005).</li><li>White, R. B., Bi&#233;rinx, A. S., Gnocchi, V. F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+muscle+fibre+growth+during+postnatal+mouse+development.">Dynamics of muscle fibre growth during postnatal mouse development.</a> BMC Developmental Biology. 10 (21), 1-11 (2010).</li><li>Siegel, A. L., Kuhlmann, P. K., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cell+proliferation+and+association:+new+insights+from+myofiber+time-lapse+imaging.">Muscle satellite cell proliferation and association: new insights from myofiber time-lapse imaging.</a> Skeletal Muscle. 2 (1), 1-7 (2011).</li><li>Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+muscle+stem+cells+by+fluorescence+activated+cell+sorting+cytometry.">Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 798, 53-64 (2012).</li><li>Engler, A. D., Griffin, M. A., Sen, S., Bonnemann, C. G., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubes+differentiate+optimally+on+substrates+with+tissue-like+stiffness:+pathological+implications+for+soft+or+stiff+microenvironments.">Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments.</a> J. Cell. Biol. 166 (4), 877-887 (2004).</li><li>Boonen, K. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+stem+cell+niche:+regulation+of+satellite+cells+during+regeneration.">The muscle stem cell niche: regulation of satellite cells during regeneration.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14 (4), 419-431 (2008).</li><li>Wozniak, A. C., Anderson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fiber+isolation+and+maintenance+of+satellite+cell+quiescence.">Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence.</a> Biochem. Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).</li><li>Verma, M., Asukura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Single+Muscle+Fiber+Isolation+from+Alcohol-Fixed+Adult+Muscle+following+&#946;-Galactosidase+Staining+for+Satellite+Cell+Detection.">Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following &#946;-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 60-67 (2001).</li><li>Wosniak, A. C., Pilipowics, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Met+expression+and+mechanical+activation+of+satellite+cells+on+cultured+muscle+fibers.">C-Met expression and mechanical activation of satellite cells on cultured muscle fibers.</a> J. Histochem. Cytochem. 51 (11), 1437-1445 (2003).</li><li>Huard, J., Feero, W. G., Watkin, S. C., Hoffman, E. P., Rosenblatt, J. D., Glorioso, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basal+lamina+is+a+physical+barrier+to+herpes+simplex+virus-mediated+gene+delivery+to+mature+muscle+fibers.">The basal lamina is a physical barrier to herpes simplex virus-mediated gene delivery to mature muscle fibers.</a> J. Virol. 70 (11), 8117-8123 (1996).</li><li>Feero, W. G., Rosenblatt, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+delivery+to+skeletal+muscle:+insights+on+maturation-dependent+loss+of+fiber+infectivity+for+adenovirus+and+herpes+simplex+type+1+viral+vectors.">Viral gene delivery to skeletal muscle: insights on maturation-dependent loss of fiber infectivity for adenovirus and herpes simplex type 1 viral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 8 (4), 371-380 (1997).</li><li>Kuang, S., Kuroda, K., grand, F. L. e., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+self-renewal+and+commitment+of+satellite+stem+cells+in+muscle.">Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle.</a> Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).</li><li>Siegel, A. L., Atchison, K., Fisher, K. E., Davis, G. E., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+timelapse+analysis+of+muscle+satellite+cell+motility.">3D timelapse analysis of muscle satellite cell motility.</a> Stem Cells. 27 (10), 2527-2538 (2009).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells.">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+adopt+divergent+fates:+a+mechanism+for+self-renewal.">Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal.</a> J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).</li></ol>

Inga konkurrerande intressen.

Isolering och odling av enstaka myofibers från intakta muskler ger en utmärkt in vitro-modell för att studera processen av muskel regenerering. En unik egenskap hos detta system är att bevara av satellit celler i deras fysiologisk miljö under basala lamina. Viktigast, kan tekniken användas för att undersöka muskel beteende stamceller i både inaktivitet och aktiverade tillstånd. Under de senaste 20 åren har myofiber kultur system som meningsfulla insikter i biologi satelliten cellpopulationen med avseende på både inre och yttre faktorer. Genom myofibers odling enskilda har satellit celler heterogenitet med avseende på myofiber, muskel typ eller regenerativ potential behandlats 15. Utarbeta studier med levande avbildning av enstaka odlade fibrer tillåts för att få information om satellit cellmigration mönster 16. Förvärvet av kvantitativa data är enLSO möjlig. Även tidskrävande, det ger viktig information om fördelningen och förekomsten av specifika händelser (stamceller asymmetrisk delning, proliferation och differentiering förhållande etc.). Tillsammans med tidigare beskrivna applikationer, är protein eller RNA-extraktion från enstaka fibrer också möjligt, men isolering av ren population av satellit celler genom FACS eller andra medel kan ge en bättre plattform för att undersöka protein eller genuttryck förändringar på en molekylär nivå. I vår erfarenhet är det mest kritiska steget för framgångsrik fiber isolering i &quot;senan till sena&quot; isolering (steg från 2,5 till 2,9 i protokollet text). Detta garanterar att efter muskel nedbrytning är fibrer frigörs från EDL med minimal eller ingen skada på så sätt öka deras prestanda i följande steg.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens / material </td></tr><tr><td> Kollagenas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Förbered färska hela tiden för optimalt resultat. Ytterligare alikvoter av outspädd kollagenas kan lagras vid -20 ° C. </td></tr><tr><td> DMEM hög Glukos + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Tillsättning av Pen / Strep är nödvändig för att minimera luft föroreningar </td></tr><tr><td> Kännetecknad fetalt bovint serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lot # KUJ35152 </td></tr><tr><td> Hästserum </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lot # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Kycklingembryo Utdrag </td><td> Accurate Chemical </td><td> CE-650-T, Batch B7035010 </td><td> Undvik frysning-upptiningscykler. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> Förvara alikvoter vid -20 ° C. Undvik frysning-upptiningscykler. Förvara utspädda alikvoter vid 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utrustning </td></tr><tr><td> Cohann-Vännäs Spring Scissor 6mm blad straight-Sharp </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Thin Iris Sax-10.5cm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Iris Tång Böjd </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur-pipetter </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Diamond Pen </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm Petri Dish </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0,22 ^ m filter </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> En ytterligare ljuskälla kan krävas för att få en bättre fokusering vy </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

Muscle förnyelse i vuxen utförs av inhemska stamceller som kallas satellit celler. Satellit celler definieras av sin position mellan basala lamina och sarcolemma varje myofiber. Aktuell kunskap om deras beteende är starkt på användningen av den enda myofiber isolering protokoll. År 1985 beskrev Bischoff ett protokoll för att isolera enstaka levande fibrer från Flexor digitorum Brevis (FDB) hos vuxna råttor med målet att skapa ett in vitro-system i vilket den fysiska associationen mellan myofiber och dess stamceller bevaras 1. År 1995 Rosenblattmodified den Bischoff protokollet så att myofibers är ensamma plockas och hanteras separat efter kollagenasdigerering istället för att isoleras genom gravitation sedimentering 2, 3. Den Rosenblatt eller Bischoff protokoll har sedan anpassats till olika muskler, ålder eller villkor 3-6. Den enda myofiber isolering tekniken är ett oumbärligtverktyg grund dess unika fördelar. Först i den gemensamma myofiber protokollet är satellit celler upprätthålls under basala lamina. Detta är en unik funktion i protokollet som andra tekniker såsom fluorescensaktiverad cellsortering kräver kemisk och mekanisk vävnadsdissociering 7. Även om myofiber kulturen systemet inte kan ersätta in vivo-studier, erbjuder det en utmärkt plattform för att hantera relevanta biologiska egenskaper hos muskelceller stamceller. Enstaka myofibers kan odlas i vanliga plätering förhållanden eller i flytande tillstånd. Satellit celler på flytande myofibers utsätts för praktiskt taget inget annat inflytande än myofiber miljön. Substrat styvhet och beläggning har visat sig påverka satellit celler förmåga att regenerera muskler 8, 9 så att kunna styra alla dessa faktorer självständigt tillåter diskriminering mellan nisch-beroende och-oberoende svar. Olika koncentrationer av serum harockså visat sig ha en effekt på övergången från passivitet till aktivering. För att bevara overksamhet tillstånd tillhörande satellit celler bör fibrer hållas i låg serummedium 1-3. Detta är särskilt användbart när man studerar gener involverade i viloläge staten. I serum rikt medium, satellit celler snabbt aktivera, proliferera, migrera och differentiera, vilket efterliknar in vivo regenerativa processen 1-3. Systemet kan användas för att utföra en mängd analyser, såsom testning av kemiska inhibitorer, ektopiskt uttryck av gener från virus leverans, oligonukleotid baserad gen knock-ner eller levande bildåtergivning. Denna video artikeln beskrivs det protokoll som för närvarande används i vårt laboratorium för att isolera enstaka myofibers från extensor digitorum longus (EDL) muskel av vuxna möss (6-8 veckor gamla).

Här har vi beskrivit isolering av enskilda myofibers från EDL muskeln i vuxna möss. Framgångsrika myofibers ger beror på flera faktorer, såsom kollagenas aktivitet eller tillstånd muskel eller ålder. Viktigast visar isoleringen av muskeln från sena till senor resulterar i långa, intakta myofibers från EDL muskel. Figur 1 ett steg för steg grafisk representation av &quot;senan till senan&quot; isolering. När muskeln är helt ned, är myofibers frigörs genom ett lätt tryck på muskeln. Figur 2A visar en representativ bild av en myofiber isolering experiment efter den första tvätten. Vid denna punkt kulturen innehåller en blandning av buntar av enskilda myofibers som visas som långa och lysande rörformiga strukturer, kontrakterade hyper myofibers som är mörk och kort och skräp från rötningsprocessen. Vid slutet av minst tre på varandra följande tvättar bör endast enstaka levande myofibers kvar i dish för odling eller nedströms analys (figur 2B). Figur 2C visar en lång, levande fibrer jämfört med en hyper kontrakterat fiber (C). Vid tidpunkten för isolering, satellit celler visas som små utsprång på ytan myofiber (figur 3A). Om den bibehålls i serum rikt medium, satellit celler aktiveras, proliferera, migrera och slutligen smälta in myotuber (B). Efter 15 dagar i odling, alla myotuber uttrycker Myf5 reportern YFP (C) tyder på att muskeln förnyelse i vuxen utförs av celler som någon gång under sin utveckling hade uttryckt det myogena avgörande faktor Myf5. Alla satellit celler uttrycker den parade rutan transkriptionsfaktor Pax7 17. Reportern muslinjen Pax7Cre-TdTomato kan användas för att spåra satellit celler via expressionen av TdTomato fluorescenssignalen (figurerna 3D och E). 4 visar en representativ Immu Figurnofluorescence av dubbel Pax7 + / MyoD satellit celler. Klassiskt dubbel Pax7 + / MyoD + satellit celler anses proliferativa engagerade muskel stamfäder som antingen slutföra differentiering programmet nedreglering Pax7 samtidigt MyoD uttryck eller återgå till viloläge genom nedreglering MyoD och underhålla Pax7 uttryck 18 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. EDL muskel isolering från mus bakben. En. Bakben på en 8 veckor gammal vuxen mus. Pilar indikerar den distala (knä) senan och den proximala (fot) senan. B. Anatomiska position tibialis anterior (TA) muskler och extensor digitorum longus (EDL) muskler. C. Genom att hålla EDL genom den proximala senan är muskeln dras mot knäet att exponera den distala senan.. D Den distala senan ärskära och EDL frigörs. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Representativa resultat av en enda myofiber isolering experiment. A. Ljusfält bild av en myofiber isolering experimentet vid första tvätten steget. Röd pil indikerar levande myofibers visar vita pilen hyper kontrakterade myofibers och gula pilen visar celler, myofiber eller ECM skräp. B. Efter varandra följande tvättningar i DMEM, endast levande myofibers återstår. C och C &#39;. Bilden är en lång intakt levande myofiber (C) och en kort hyper kontrakterade myofiber (C). Bar 10 um. Bilder togs med en Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop utrustat med AxioCam HR. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur<html> e 3. Representativa resultat av en enda myofiber kultur experiment. A. Ljusfält bild av en enda, levande myofiber med tillhörande satellit celler (pil) direkt efter isoleringen (Tid 0). B. Enstaka myofibers ströks på Matrigel och odlades i serum rikt medium under 15 dagar. Vita pilen visar differentierade myotuber jämfört med enstaka celler (gul pil) C. Enstaka myofibers från en Myf5Cre, var RosaYFP mus odlades som i B. Pilen anger Myf5 härledda myotuber. D och E. Enstaka myofibers från Pax7Cre, TdTomato isolerades och fast direkt efter. Pilar indikerar Pax7 positiv vilande satellit-cell (E, röd). Kärnor motfärgades med DAPI (D). Bar: 50 | im. Bilder togs med en Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop utrustat med AxioCam HR. sätt &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Figur 4"/> Figur 4. Exempel på immunofluorescensfärgning av satellit celler på myofibers. Enstaka myofibers isolerades och odlades under 72 timmar i flytande tillstånd. Satellit celler på myofibers färgades för satellit cellspecifika markören Pax7 (B, röd) och den myogena regulatoriska faktorn MyoD (C, grön). Kärnor motfärgades med DAPI (A). Staplar: 50 um. Bilder togs med en Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop utrustat med AxioCam HR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Muscle Dissection (5 min varje muskel) </td><td><ul><li> Sena för sena isolering </li><li> Skarpa verktyg </li><li> Minimal muskelskada </li></ul></td></tr><tr><td> Muskel Digestion (30-45 min) </td><td><ul><li> Temperaturkänsliga </li><li> Undvik overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber isolering </td><td><ul><li> Undvika alltför manipulering av fibrer </li><li> Eliminera skräp med flera tvättar </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber Kultur (upp till 3-4 veckor) </td><td><ul><li> Format: alla </li><li> Beläggning: hästserum, Matrigel </li><li> Medium: basal eller hög serum </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Översikt över myofiber isolering protokollet. Myofiber isolering protokoll består av 4 stora steg. För varje steg är den ungefärliga tid och stora kritiska punkter diskuteras. För detaljerad diskussion av varje steg, se protokollet texten.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle at JoVE.com

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering och odling av myofibers är guldmyntfoten<em&gt; In vitro</em&gt; För att studera övergången av satellit celler genom passivitet, aktivering och differentiering. Viktigt bevarar den enda myofiber kulturen system myofiber / stamceller förening, som är en viktig del av muskeln stamceller nisch.

Isolering och odling av individuella Myofibers och deras satellit celler från vuxna skelettmuskulatur

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitokondriell Isolering från skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolering och odling av vuxna Epithelial stamceller från mänskliga Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analys av embryonala och Larvernas Zebrafish Skelett myofibers från Dissocierade Förberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolering, kultur, och transplantation av muskelsatellitceller

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering av blod-kärl-härledda multi prekursorer från Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering och kultur av Dental epitelceller stamceller från vuxen mus Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, isolering och avbildning av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering och kultur av primära muskeratinocyter från neonatal och vuxen mushud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering och karakterisering av exosomer från skelettmuskulaturfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...