Name: isolation and culture of mouse cortical astrocytes
Uploaded: 2013-01-19T14:00:00
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Soutenu par la Fondation de bourses d&#39;études supérieures à Fazit SS, le ministère fédéral de l&#39;Education et de la Recherche (BMBF 01 EO 0803) à Ko et la Commission européenne FP7 Grant PIRG08-GA-2010-276989, Neurex, et la fondation allemande de recherche Grant SCHA 1442 / 3-1 à CS Les auteurs n&#39;ont pas de conflits d&#39;intérêts financiers.

1. Isolement et placage de Mixed cellules corticales Mixte isolement des cellules corticales des cultures d&#39;astrocytes peuvent être effectuées à l&#39;aide de P1 à P4 souriceaux. Afin de parvenir à un bon densité des astrocytes, il est nécessaire d&#39;utiliser 4 cortex de souris chiot par T75 flacon de culture tissulaire. Par conséquent, les volumes dans le protocole suivant sont calculés pour une préparation de cellules en utilisant 4 souriceaux. <ol><li> Avant de commencer...

<ol>
	<li>Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+roles+for+astrocytes:+redefining+the+functional+architecture+of+the+brain.">New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain.</a> Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).</li><li>Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energy+metabolism:+focus+on+astrocyte-neuron+metabolic+cooperation.">Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation.</a> Cell Metab. 14, 724-738 (2011).</li><li>Allen, N. J., Barres, B. 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Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).</li><li>Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes:+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair.">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).</li><li>Schachtrup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+triggers+astrocyte+scar+formation+by+promoting+the+availability+of+active+TGF-beta+after+vascular+damage.">Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage.</a> J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. 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Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).</li><li>Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+damage+in+the+central+nervous+system:+a+multifaceted+role+for+vascular-derived+TGF-beta.">Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta.</a> Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Siao, C. J., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+plasminogen+activator+mediates+microglial+activation+via+its+finger+domain+through+annexin+II.">Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II.</a> J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li><li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+database+for+astrocytes,+neurons,+and+oligodendrocytes:+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function.">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li><li>Anthony, T. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+folate+metabolic+enzyme+ALDH1L1+is+restricted+to+the+midline+of+the+early+CNS,+suggesting+a+role+in+human+neural+tube+defects.">The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects.</a> J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).</li><li>Skoff, R. P., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+astroblasts+and+oligodendroblasts+in+postnatal+rodent+brain:+evidence+for+separate+astrocyte+and+oligodendrocyte+lineages.">Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages.</a> Glia. 4, 165-174 (1991).</li><li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+disease:+a+neurodevelopmental+perspective.">Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective.</a> Genes Dev. 26, 891-907 (2012).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71, 799-811 (2011).</li><li>Jungblut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+living+primary+astroglial+cells+using+the+new+GLAST-specific+monoclonal+antibody+ACSA-1.">Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1.</a> Glia. 60, 894-907 (2012).</li></ol>

La méthode décrite ici est basée sur la préparation des cultures d&#39;astrocytes à partir de cerveaux de rongeurs nouveau-nés, initialement décrite par McCarthy et de Vellis en 1980 27. La méthode modifiée de l&#39;isolement et la culture des astrocytes corticaux de P1 à P4 postnatal du cerveau de souris présentée ici est rapide, rendements pures astrocytes primaires et est hautement reproductible. Cette technique peut facilement être transférée à isoler les astrocytes à partir d&#39;autres ...

Les astrocytes sont un type cellulaire très abondante dans le système nerveux central (SNC). Le ratio des astrocytes aux neurones est de 1:3 dans le cortex des souris et des rats, alors il ya 1,4 astrocytes par neurone dans le cortex humain 1. L&#39;intérêt pour la fonction des astrocytes a augmenté de façon spectaculaire ces dernières années. Une des principales fonctions des astrocytes est leur rôle dans le soutien structural et métabolique des neurones 2,3. Rôles récemment découverts pour astrocytes couvrent un large éventail de fonctions. Il s&#39;agit notamment de guidage de la migration des axones et des neuroblastes développement au cours du développement de certaines 4-6, fonctions de la transmission synaptique, la force des synapses et de traitement d&#39;informations par des circuits neuronaux 7-9, les rôles de barrière hémato-encéphalique (BHE) formation 10 et 11-13 intégrité et la réglementation des 14 tonus cérébrovasculaire. Une autre caractéristique importante des astrocytes est leur réponse à une blessure. Sous astrocyt conditions pathologiqueses devenue plus réactive et augmentent l&#39;expression de la protéine intermédiaire filament gliale fibrillaire acide (GFAP) et inhibiteurs de la matrice extracellulaire (ECM) 15,16 protéines. Astrocytes réactifs délimiter le site de la lésion des tissus sains en formant une cicatrice gliale, qui se compose principalement d&#39;astrocytes protéines de la MEC sécrétées de la chondroïtine sulfate protéoglycanes (GCEP) de la famille, les principaux facteurs qui inhibent la régénération axonale après une lésion du SNC 15-17. Les astrocytes proviennent gliales radiales (RG), les cellules lors de l&#39;embryogenèse fin et au début de la vie postnatale. Après la spécification des astrocytes a eu lieu, précurseurs astrocytaires migrer vers leurs positions finales, où ils commencent le processus de différenciation terminale. In vivo, les astrocytes semblent être mature trois à quatre semaines après la naissance, comme indiqué par leur morphologie typique 18,19. Une sous-population de cellules RG convertir en zone sous-ventriculaire (astrocytes de type cellules B). Both, RG et les cellules de type B fonctionnent comme des astrocytes de type cellules souches neurales (NSC) au cours du développement et chez l&#39;adulte, respectivement. Comme les astrocytes, cellules RG et de type B expriment également le transporteur du glutamate astrocytes spécifique (GLAST), le cerveau des lipides-binding protein (BLBP), et de la GFAP, ce qui indique que ces marqueurs ne peuvent pas être exclusivement utilisé pour marquer spécifiquement les astrocytes adultes. Contrairement aux adultes, les astrocytes parenchymateux, qui ne se divisent pas dans le cerveau, RG sain et cellules de type B présentent un potentiel de cellules souches telles que la capacité d&#39;auto-renouvellement. Le dérèglement des astrocytes a été impliquée dans de nombreuses pathologies, y compris la maladie d&#39;Alzheimer 20,21, la maladie de Huntington 22, la maladie de Parkinson 23, le syndrome de Rett 24 et la maladie d&#39;Alexander 25. Par ailleurs, les astrocytes réagir à toutes les injures du système nerveux central, conduisant à l&#39;activation des astrocytes et astrocytaire formation cicatrice gliale 16,26. La cicatrice gliale astrocytaire qui forme tr cerveau suivantelésions de la moelle épinière ou auma est considéré comme le principal obstacle empêchant la régénération neuronale 15. Le développement de méthodes fiables d&#39;isoler et de maintenir des populations purifiées de cellules a été essentielle à notre compréhension du système nerveux. Travaux pionniers de McCarthy et de Vellis permet aux enquêteurs à ce jour pour préparer des cultures d&#39;astrocytes presque purs de tissu de rat nouveau-né 27. On a beaucoup appris sur la biologie des astrocytes en utilisant cette méthode, qui est présentée ici sous une forme légèrement modifiée pour isoler les astrocytes corticaux de souris. En complément des études in vivo, les astrocytes, ainsi que le milieu conditionné obtenu en utilisant le décrit la culture in vitro, sont des outils précieux pour mieux avoir un aperçu des fonctions astrocytes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de la solution de travail </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Milieux de culture d&#39;astrocytes </td></tr><tr><td> DMEM, glycémie élevée </td><td> Life Technologies </td><td> 31966-021 </td><td></td></tr><tr><td> FBS, inactivé à la chaleur </td><td> Life Technologies </td><td> 10082-147 </td><td> Concentration finale: 10% </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td><td> Concentration finale: 1% </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solution pour creuser le tissu cérébralestion </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Life Technologies </td><td> 14170-088 </td><td></td></tr><tr><td> La trypsine 2,5% </td><td> Life Technologies </td><td> 15090-046 </td><td> Concentration finale: 0,25% </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Autre </td></tr><tr><td> 70% (volume / volume) d&#39;éthanol </td><td> Roth </td><td> 9065.2 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine </td><td> Millipore </td><td> A-003-E </td><td> 50 pg / ml </td></tr><tr><td> Eau </td><td> AAP </td><td> S15-012 </td><td> de qualité culture cellulaire </td></tr><tr><td> PBS </td><td> AAP </td><td> H15-002 </td><td> de qualité culture cellulaire </td></tr><tr><td> Essayez de 0,05%PSIN-EDTA </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre de 0,45 um stérile </td><td> Sartorius </td><td> 16555 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 cm boîte de Pétri </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Falcon de 15 ml Tube </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> Falcon de 50 ml Tube </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 flacon de culture tissulaire </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps, bien </td><td> Dumont </td><td> 2-1032, 2-1033 </td><td> # 3c; # 5 </td></tr><tr><td> Forceps, embout plat </td><td> KLS Martin </td><td> 12-120-11 </td><td></td></tr><tr><td> 13 cm ciseaux chirurgicaux </td><td> Aesculap </td><td> BC-140-R </td><td></td></tr><tr><td> Stéréomicroscope </td><td> Leica </td><td></td><td> MZ7.5 </td></tr><tr><td> Stéréomicroscope + Caméra </td><td> Leica </td><td></td><td> MZ16F; DFC320 </td></tr><tr><td> Microscope + Caméra </td><td> Zeiss; Canon </td><td></td><td> Primo Vert; PowerShot A650 IS </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Eppendorf </td><td> 5805000.017 </td><td> Centrifuge5804R </td></tr><tr><td> Agitateur orbital </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKE 4450-1CE </td><td> MaxQ 4450 </td></tr><tr><td> Bain d&#39;eau </td><td> Julabo </td><td></td><td> SW20; 37 ° C </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of mouse cortical astrocytes

Les astrocytes sont un type de cellule abondant dans le cerveau des mammifères, mais il reste beaucoup à apprendre sur leurs caractéristiques moléculaires et fonctionnelles. Astrocytes in vitro systèmes de culture cellulaire peut être utilisé pour étudier les fonctions biologiques de ces cellules gliales dans le détail. Ce protocole vidéo montre comment obtenir les astrocytes pures par l&#39;isolement et la culture des cellules corticales mixtes de souriceaux. La méthode est basée sur l&#39;absence de neurones viables et la séparation des astrocytes, les oligodendrocytes et les microglies, les trois principales populations de cellules gliales du système nerveux central, de la culture. Images représentatifs au cours des premiers jours de culture en évidence la présence d&#39;une population cellulaire mixte et indiquer le point temporel, lorsque les astrocytes deviennent confluentes et ne doit être séparé de la microglie et les oligodendrocytes. De plus, nous démontrons la pureté et de la morphologie des astrocytes astrocytes en culture en utilisant des colorations immunocytochimiques pour bien établies etnouvellement décrit marqueurs astrocytaires. Ce système de culture peut être facilement utilisé pour obtenir des astrocytes de souris pures et astrocytes conditionné moyen pour étudier divers aspects de la biologie des astrocytes.

Après isolement du cerveau de la souris complète (figure 1A), le cervelet et des bulbes olfactifs doivent être éliminés (figure 1B). Les cortex sont pelées de la tige de cerveau de souris (figure 1C) et les méninges du cortex individuel (figure 1D ») sont soigneusement retirés (figure 1E). Méninges sont évidents par le système de l&#39;artère méningée et les résultats élimination incomplète de la contamination de la cu...

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Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Les astrocytes ont été reconnus pour être des cellules polyvalentes qui participent au processus biologiques fondamentaux qui sont essentiels pour le développement normal du cerveau et la fonction, et réparation du système nerveux central. Nous présentons ici une procédure rapide afin d&#39;obtenir des cultures pures astrocytes de souris pour étudier la biologie de cette classe importante de cellules du système nerveux central.

Isolement et culture des astrocytes corticaux de souris

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Recherche

Neurosciences

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectine à base d&#39;isolement et de la culture des motoneurones embryonnaires de la souris

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Didermique co-culture de neurones de rat corticale primaire et des cellules gliales

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

L&#39;isolement et la culture de neurones de l&#39;hippocampe de souris pendant la grossesse

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Isolement et culture de cellules humaines fongiformes papilles gustatives

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolement du liquide céphalo-rachidien à partir d&#39;embryons de rongeurs pour une utilisation avec des explants cérébraux corticaux disséqué

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modélisation astrocytome pathogenèse<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Différences entre les sexes dans la souris hippocampiques astrocytes après<em&gt; In-Vitro</em&gt; ischémie

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...