Name: generation and recovery of &beta;-cell spheroids from step-growth peg-peptide hydrogels
Uploaded: 2012-12-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Recovery of ÃŽÂ²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels at JoVE.com

이 프로젝트는 NIH (R21EB013717)와 IUPUI OVCR (RSFG)에 의해 재정 지원되었다. 저자는 그녀의 기술 지원을 위해 양 한 Shih 감사드립니다.

A. Macromer 및 펩타이드 합성 <ol><li> 기존 프로토콜을 사용하여 4 - 팔 PEG-norbornene (PEG4NB)와 photoinitiator의 리튬 arylphosphanate (랩). 18,19를 합성 </li><li> 합성 키모 트립신에 민감한 펩타이드를 포함하는 비스 - 시스테인 CGGY ↓ C 전자 펩타이드 합성기 (CEM 디스 SPS)에 표준 고체 상 펩타이드 합성을 사용하여 (화살표가 키모 트립신의 절단 사이트를 나타냅니다).에게 <ol class="lalpha"><li> 수지와 합성 ...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).</li><li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+hydrogels+for+the+controlled+release+of+biomolecules+in+regenerative+medicine.">PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine.</a> Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).</li><li>Lin, C. C., Metters, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+in+controlled+release+formulations:+network+design+and+mathematical+modeling.">Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling.</a> Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).</li><li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions.">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7, 830-838 (2011).</li><li>Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. 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C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids.">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).</li><li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+functionalized+PEG+hydrogels+promote+survival+and+function+of+encapsulated+pancreatic+beta-cells.">Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells.</a> Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).</li><li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+mimicry+with+poly(ethylene+glycol)+hydrogels+for+enhancing+beta-cell+function.">Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).</li><li>Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+inhibits+apoptosis+of+insulin-secreting+cells+via+a+cyclic+5'-adenosine+monophosphate-dependent+protein+kinase+A-+and+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway.">Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).</li><li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function.">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).</li><li>Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cell-matrix+interactions+on+encapsulated+beta-cell+function+within+hydrogels+functionalized+with+matrix-derived+adhesive+peptides.">The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides.</a> Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).</li><li>Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K-sensitive+poly(ethylene+glycol)+hydrogels+for+degradation+in+response+to+bone+resorption.">Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).</li><li>Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently-immobilized+vascular+endothelial+growth+factor+promotes+endothelial+cell+tubulogenesis+in+poly(ethylene+glycol)+diacrylate+hydrogels.">Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels.</a> Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).</li><li>Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+of+poly(ethylene+glycol)+diacrylate+hydrogels+with+biomolecules+to+regulate+and+guide+endothelial+morphogenesis.">Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis.</a> Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).</li><li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-ene+click+chemistry.">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).</li><li>Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-click+chemistry:+a+multifaceted+toolbox+for+small+molecule+and+polymer+synthesis.">Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis.</a> Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).</li><li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Synthetic+Extracellular+Matrix+Mimic+via+Thiol-Norbornene+Photopolymerization.">A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization.</a> Adv. Mater. 21, 5005 (2009).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).</li><li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+release+from+hydrolytically+degradable+poly(ethylene+glycol)+hydrogels.">Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).</li></ol>

설명 프로토콜은 스텝 성장 photopolymerization에 의해 형성 thiol-에너지의 hydrogels의 셀을 쉽게 캡슐화에 대한 자세한 정보를 제공합니다. thiol 기능 그룹에 norbornene의 1시 1분의 화학 양 론적 비율이 프로토콜에 사용 된 동안의 비율은 실험에 따라 조정할 수 있습니다. 올바른 배합뿐만 아니라, 그것은 사전 고분자 용액에서 동질성을 유지하는 것이 중요합니다. 특히, 겔 속성에서 셀 및 유사 거리며 걷?...

Hydrogels는. 수리 및 재생 조직을위한 발판 재료 등의 뛰어난 잠재력을 지닌 친수성 가교 중합체 hydrogels 1-3 높은 물 콘텐츠는 산소와 세포 생존 능력을 유지하는데 중요한 역할을하는 다양한 영양소와 세포의 신진 대사 제품의 교환을 쉽게 확산을 할 수 있습니다. 또한, hydrogels는 제어 자료와 높은 tunability 인해 세포 제공을위한 훌륭한 캐리어입니다. 같은 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)에서 준비 것과 같은이 합성 hydrogels가 점점 더 크게 인해 cytocompatibility에, 조직 공학 응용 분야에 사용되며, 조직 - 재료 물리적, 기계적 성질을에서와 같은 탄성, 높은 tunability. 4-6 일반적으로 사용되는 히드로 겔 플랫폼이지만, 연구 체인 성장 photopolymerizations에 의해 형성 PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels는 캡슐화 세포에게 duri을 손상하는 경향이 있습니다 것으로 나타났습니다NG 네트워크 crosslinking 및 현장 세포 캡슐화 인치 7 세포의 손상은 크게 hydrogels에 crosslink 폴리머 체인에 PEGDA에 비닐 그룹을 통해 전달 photoinitiator 분자에 의해 생성 된 라디칼 종에 기인했다. 불행하게도, 이러한 급진적 인 종은 특히 췌장 β-세포와 같은 급진적 인에 민감한 세포에 대해 세포 캡슐화하는 동안 스트레스와 세포 손상을 유발할 수 있습니다. 8-10은 위해 더 나은 확산 및 세포 생존, 높은 분자량 PEGDA에 대한 높은 메쉬 크기를 얻기 위해 종종 세포 캡슐화하는 데 사용됩니다. 그러나, 중합 반응 속도론을 떨어 뜨리고 하위 최적의 젤 biophysical 속성을 발생합니다. 7,11,12은 위에서 언급 한 단점 외에도,이 때문에의 이질성과 비 degradable 자연 PEGDA의 hydrogels에서 셀 구조를 복구하는 것은 매우 어렵습니다 가교 네트워크. 단백 분해 효소에 민감한 펩티드는 통합 될 수 있지만효소 절단에 민감한 기타 불활성 PEGDA의 hydrogels을 렌더링하기 위해 PEG macromer 백본으로, 활용은 종종 고가의 시약을 사용하고 그 결과 네트워크는 여전히 인해 체인 성장 중합의 성격에 이질성의 높은 수준을 포함합니다. 13-15 최근 단계 성장 thiol-에너지의 photopolymerization을 통해 형성 PEG-펩타이드 hydrogels은 체인 성장 photopolymerization에 의해 형성 hydrogels을 통해 세포 캡슐화에 대한 특혜 속성을 전시하기 위해 표시되었습니다. thiol - 에너지 hydrogels 7 우수한 겔화 반응 속도론은 &#39;클릭에 따라 결정됩니다 thiol과 ​​에너지 절약의 기능 사이의 반응의 &#39;자연. PEGDA의 체인 성장 중합에 비해, thiol-에너지 반응이있는 빠른 겔화 속도의 결과. 산소는 16,17 Thiol-에너지의 hydrogels도 높은 중합 효율성과 체인 성장 PEGDA hydrogels, 7에 비해 더 나은 젤 biophysical 속성이 저해됩니다 18 &lt;/ 저녁을 먹다&gt; 이는 photopolymerization 동안 급진적 인 종으로 인한 제한된 세포의 손상을 발생합니다. 이전 thiol-에너지의 hydrogels 4 - 팔 PEG-norbornene (PEG4NB) macromer과 같은 비스 - 시스테인이 포함 된 펩타이드 crosslinkers에 의해 형성 단백 분해 효소에 민감한 펩티드가 세포 캡슐화에 활용하고 있습니다. PEG의 히드로 겔 네트워크 7,18 높은 tunability가 있습니다 세포 생존과 활동을 조사하는 유연하고 제어 3D microenvironment, 단백 분해 효소에 민감한 펩타이드 시퀀스의 사용 hydrogels 내에서 자연적으로 형성 세포 구조의 복구를위한 온난 한 방법을 제공하는 동안. 이 프로토콜에서 우리는 4 팔 PEG-norbornene (PEG4NB)와 MIN6 β-세포의 캡슐화를위한 키모 트립신에 민감한 펩타이드 crosslinker (CGGY ↓ C)를 사용하여 제조 단계 성장 photopolymerized thiol-에너지 hydrogels를 사용합니다. 이 프로토콜은 체계적으로 MIN6의 생존, 증식과 회전 타원체 형성을 공부에 대한 기술을 elaboratesthiol-에너지의 hydrogels의 β-세포. 우리는 더 β-세포 회전 타원체 복구 및 복구 spheroids의 생물학적 특성에 대한 방법을 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 4 팔 PEG (20kDa) </td><td> Jenkem 기술 USA </td><td> 4ARM-PEG-20K </td><td></td></tr><tr><td> Fmoc-아미노산 </td><td> Anaspec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 죽은 / 라이브 세포 생존 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> L3224 </td><td> Calcein AM 및 Ethidium homodimer-1을 포함 </td></tr><tr><td> AlamarBlue 시약 </td><td> 아브드 Serotec </td><td> BUF012 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter 형광 시약 </td><td> Promega </td><td> G7570 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Lonza </td><td> 17 512F </td><td> 칼슘이와 MG 2없이 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Lonza </td><td> 10547F </td><td> 없이칼슘이와 MG 2 </td></tr><tr><td> 높은 포도당 DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000-044 </td><td></td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> β-메르 캅토 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M7522-100ML </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400-054 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 무료 α-키모 트립신 </td><td> 워싱턴 생물 화학 주식회사 </td><td> LS001432 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 Inusin 엘리사 키트 </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td><td></td></tr><tr><td> 한 ML 일회용 주사기 </td><td> BD biosciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and recovery of &beta;-cell spheroids from step-growth peg-peptide hydrogels

Hydrogels는 배양 therapeutically 관련성이 높은 셀이나 조직에 탄력과 높은 투자율 조직과 같은과 3 차원 microenvironment를 제공 친수성 ​​가교 폴리머입니다. 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 파생 상품에서 준비 Hydrogels는 점점 자신의 조정할 수 있으며 cytocompatible 특성으로 인해 부분적으로 조직 공학 응용 프로그램의 다양한 사용됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 췌장 MIN6 B-세포를 캡슐화에 대한 PEG-펩타이드 hydrogels를 조작하는 thiol - 에너지 스텝 성장 photopolymerizations를 활용. 젤은 4 - 팔 PEG-norbornene (PEG4NB) macromer과 키모 트립신에 민감한 펩타이드 crosslinker (CGGYC)에 의해 형성되었다. PEG의 친수성과 비 오염 자연은, 3D로 세포 생존과 증식을위한 cytocompatible microenvironment를 제공하며 키모 트립신에 민감한 펩타이드 시퀀스 (의 사용 C GGY ↓ C, 화살표 효소 절단 사이트를 나타냅니다 반면, 터미널 낭종나란히 잔류)가 thiol-에너지의 crosslinking에 추가 된 히드로 겔 내에서 형성 세포 구조의 급속한 복구를 할 수 있습니다. 다음 프로토콜에 대한 기술을 elaborates : thiol-에너지 hydrogels에 MIN6 β-세포의 (1) 봉지 (2) 질적 및 양적 세포 생존 능력의 assays는 세포 생존과 증식을 결정하기 위해, (3) 세포 spheroids의 복구 키모 트립신로 인한 젤을 사용하여 침식 및 복구 spheroids (4) 구조 및 기능 분석.

<html> 그림 캡슐화, 생존, 증식, 회전 타원체 형성, thiol-에너지의 hydrogels의 회전 타원체 복구를 위해 1-4 표시 대표 결과입니다. 그림 1은 PEG4NB과 CGGYC를 사용하여 (1) 단계 성장 thiol-에너지의 photopolymerization의 반응 도식을 보여줍니다, 그리고 ( 표면 침식 메커니즘을 다음과 2) 키모 트립신 매개 젤 침식. 라이브 / 데드 착색 및 AlamarBlue 분석을 사용하여 수득?...

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Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

다음 프로토콜은 thiol - 에너지 사진을 클릭 반응에 의해 형성 단계 성장 PEG-펩타이드 hydrogels에서 췌장 β-세포를 캡슐화에 대한 기술을 제공합니다. 이 물질 플랫폼은 세포 캡슐화에 대한 cytocompatible microenvironment를 제공뿐만 아니라 hydrogels 내에 형성된 세포 구조의 사용자 관리 빠른 복구를 허용합니다뿐만 아니라.

단계 성장 PEG-펩타이드 Hydrogels에서 β-세포 Spheroids의 생성 및 복구

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

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3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

연구

생체공학

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치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

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3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

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캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

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