Name: 4d imaging of protein aggregation in live cells
Uploaded: 2013-04-05T12:00:00
Duration: 8 min 59 s
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	<li>Gershenson, A., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+in+the+cell:+challenges+and+progress.">Protein folding in the cell: challenges and progress.</a> Current opinion in structural biology. 21, 32-41 (2011).</li><li>Aguzzi, A., Calella, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions:+protein+aggregation+and+infectious+diseases.">Prions: protein aggregation and infectious diseases.</a> Physiological reviews. 89, 1105-1152 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteotoxic+stress+and+inducible+chaperone+networks+in+neurodegenerative+disease+and+aging.">Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging.</a> Genes &amp; development. 22, 1427-14 (2008).</li><li>Cohen, E., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+paradox:+aging,+proteotoxicity+and+neurodegeneration.">The insulin paradox: aging, proteotoxicity and neurodegeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. , (2008).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, (1998).</li><li>Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+for+controlling+protein+aggregation.+Nature+reviews.">Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 11, 777-788 (2010).</li><li>Treusch, S., Cyr, D. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposits:+Protection+against+toxic+protein+species?.">Amyloid deposits: Protection against toxic protein species?.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex.). 8, 1668-1674 (2009).</li><li>Spokoini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confinement+to+Organelle-Associated+Inclusion+Structures+Mediates+Asymmetric+Inheritance+of+Aggregated+Protein+in+Budding+Yeast.">Confinement to Organelle-Associated Inclusion Structures Mediates Asymmetric Inheritance of Aggregated Protein in Budding Yeast.</a> Cell Rep. , (2012).</li><li>Weisberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+superoxide+dismutase+1+(SOD1G93A)+aggregates+determines+their+toxicity.">Compartmentalization of superoxide dismutase 1 (SOD1G93A) aggregates determines their toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15811-15816 (2012).</li><li>Kaganovich, D., Kopito, R., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misfolded+proteins+partition+between+two+distinct+quality+control+compartments.">Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments.</a> Nature. 454, 1088 (2008).</li><li>Betting, J., Seufert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+Ubc9+mutant+protein+with+temperature-sensitive+in+vivo+function+is+subject+to+conditional+proteolysis+by+a+ubiquitin-+and+proteasome-dependent+pathway.">A yeast Ubc9 mutant protein with temperature-sensitive in vivo function is subject to conditional proteolysis by a ubiquitin- and proteasome-dependent pathway.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 25790 (1996).</li><li>Tongaonkar, P., Beck, K., Shinde, U. P., Madura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+temperature-sensitive+mutant+of+a+ubiquitin-conjugating+enzyme+and+its+use+as+a+heat-inducible+degradation+signal.">Characterization of a temperature-sensitive mutant of a ubiquitin-conjugating enzyme and its use as a heat-inducible degradation signal.</a> Analytical biochemistry. 272, 263 (1999).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के बारे में हमारी intuitions बेंच शीर्ष प्रयोगों में जो reactants और उत्पादों की एक अच्छी तरह से मिश्रित समाधान एक बीकर में संतुलन तक पहुँचने की अनुमति दी है से निकाले जाते हैं. इस तरह के एक सेटिंग में, किसी दिए गए रासायनिक प्रजातियों की एकाग्रता एक ही नंबर है, जो एक macroscopic मात्रा में अणुओं की एक दाढ़ मात्रा के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जा सकता है. पश्चिमी blots, centrifugations, और spectrophotometric माप कोशिकाओं की पूरी आबादी के homogenates से निष्कर्षों पर बाहर किया जाता है: क्या हम प्रोटीन संरचना और कार्य के बारे में पता है की ज्यादातर तरीकों कि क्लासिक, थोक प्रतिक्रिया तस्वीर को प्रतिबिंबित का उपयोग करने से निकला है. प्रौद्योगिकी हम आवर्धन के तहत कोशिकाओं में देखने के लिए उपयोग के रूप में कई गुना से सुधार है, यह कभी स्पष्ट है कि जिन स्थितियों में सबसे जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं vivo में जगह लेने के केवल थोड़ी सी क्लासिक बेंच शीर्ष परिदृश्य के उन लोगों के लिए सादृश्य भालू हो जाता है. न केवल cel के इंटीरियरला घनी पर्यावरण पैक, जो भीड़ प्रभाव काफी हद तक विभिन्न reactants की गतिविधियों को बदलने के लिए, यह भी काफी अच्छी तरह से मिश्रित के विपरीत है. इन विट्रो में और जटिल macromolecular प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के vivo क्षमता के बीच लगातार असमानता के लिए यह खातों. कहीं इन विट्रो जैव रासायनिक vivo तह, misfolding, और प्रोटीन का एकत्रीकरण में संबंधित प्रश्नों के रूप में गुमराह करने के लिए प्रवण प्रयोगों में शास्त्रीय से stemming intuitions हैं. जबकि थोक प्रतिक्रियाओं में प्रोटीन रसायन शास्त्र के अध्ययन एक सरल हाँ या कोई सवाल के रूप में एक भी प्रोटीन के लिए तह के मुद्दे का इलाज कर सकते हैं, किसी भी तरह से एक जीवित कोशिका में बड़े अणुओं की पूरी आबादी की गतिशीलता को ट्रैक करने की कोशिश संभव के पूरे वितरण के लिए संवेदनशील होना चाहिए एक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के लिए उपलब्ध गठनात्मक परिणाम है, और misfolding और एकत्रीकरण के जोखिम के लिए विशेष रूप से. उदाहरण के लिए, हम एक थोक सेल ly की जांच हो सकती हैपश्चिमी सोख्ता द्वारा कुल प्रोटीन की ऊबाना, और तय है कि प्रोटीन ज्यादातर अघुलनशील और नहीं ubiquitinated है. हालांकि, जीवित कोशिका में प्रोटीन का एक असतत उप - जनसंख्या, पता लगाने के लिए जब कई कोशिकाओं औसत मुश्किल, घुलनशील और जहां प्रजातियों में स्थानीय एकाग्रता अत्यंत उच्च है एक विशेष डिब्बे में ubiquitinated हो सकता है. बाद के परिदृश्य बड़े थोक उप जनसंख्या की तुलना में सेल की व्यवहार्यता के लिए अधिक महत्वपूर्ण परिणाम हो सकते हैं. इसके अलावा, जबकि संरक्षिकाओं इन विट्रो में pleiotropic व्यवहार और कार्यों की एक किस्म प्रदर्शन, यह स्पष्ट होता जा रहा है कि सेल में उनके असतत कार्य spatially और अस्थायी रूप से सीमित कर रहे हैं. जैव रसायन समझने के लिए नए उभरते प्रतिमान में एकाग्रता सेल में प्रत्येक विशिष्ट नैनो पर्यावरण की एक चर संपत्ति हो जाता है, और आणविक घटनाओं है कि जैविक प्रक्रियाओं आबाद न केवल समय में assayed किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी spac मेंई. 4D इमेजिंग यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन misfolding के संवेदनशील मॉडलिंग के लिए सक्षम बनाता है, हालांकि यह अन्य जैविक प्रक्रियाओं के किसी भी संख्या का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कैसे वे अंतरिक्ष में विनियमित रहे हैं, समय है, और पर्यावरण की स्थिति में परिवर्तन के बाद. इस पत्र में हम Ubc9 टीएस तह सेंसर का उपयोग करते हैं, जो प्रभावी चरणों cytosol में प्रोटीन एकत्रीकरण की शुरुआत के साथ निपटने के लिए और विकल्पों को दर्शाता है. एकत्रीकरण गुणवत्ता नियंत्रण की कोशिका जीव विज्ञान illustrating के अलावा, इस दृष्टिकोण Proteostasis (उदाहरण के लिए Ubc9 टीएस ऑक्सीकरण के लिए प्रतिक्रिया में प्रोटीन तह तनाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर विशिष्ट perturbations या आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव का गूढ़ रहस्य के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं, एक जहरीले कुल, या गुणवत्ता नियंत्रण के मार्ग में परिवर्तन) की अभिव्यक्ति. 4D इमेजिंग भी सही प्रोटीन या दो अलग अलग प्रोटीन के बीच स्थानीयकरण colocalization का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हैहै, और जो शायद क्षणिक लेकिन महत्वपूर्ण घटना का पता लगाने के लिए. उदाहरण के लिए, खमीर जैसे एक छोटे गोलाकार जीव में विशेष रूप से, यह मामला है कि एक संरचना या कुल juxtanuclear स्थानीयकरण है, जबकि 4D इमेजिंग बता सकता है कि इस बस निरीक्षण के कोण की एक artifact है प्रकट हो सकता है. उदाहरण प्रयोग हम यहां उपस्थित में, हम दिखाना एक मॉडल का उपयोग प्रोटीन, Ubc9 टीएस misfolded एकत्रीकरण और cytosol में समय और स्थान पर गुणवत्ता नियंत्रण का पालन करें. स्वतंत्र तापमान में, Ubc9 टीएस मुड़ा और नाभिक और cytosol में दूर तक फैला हुआ है. गर्मी प्रेरित misfolding पर, यह शुरू में तेजी से diffusing छोटे कुल तनाव foci कि proteasomal गिरावट के लिए कार्रवाई कर रहे हैं रूपों. जब एंटीबॉडी आंशिक रूप से हिचकते हैं, इन तनाव foci JUNQ और आइपॉड inclusions में के बारे में 2 घंटे के पाठ्यक्रम पर परिवर्तित कर रहे हैं. यदि ubiquitin की मध्यस्थता गिरावट एक गुणवत्ता नियंत्रण विकल्प, यूबी के रूप में उपलब्ध नहीं हैC9 टीएस तुरंत सुरक्षात्मक एकत्रीकरण के लिए आइपॉड शामिल किए जाने के लिए फिर से कराई. ये उपकरण उपन्यास आनुवंशिक एकत्रीकरण गुणवत्ता नियंत्रण में शामिल कारकों का पता चलता है, और अपने सेल में स्थानिक और लौकिक विनियमन का पता लगाने के लिए अविश्वसनीय अवसर प्रदान करते हैं.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>mbs474790</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>con A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom plates</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>ibd81158</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation 
			Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d imaging of protein aggregation in live cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

<html><img alt="चित्रा 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> चित्रा 1. आदर्श: misfolded प्रोटीन का उप सेलुलर compartmentalization अलग कार्यों के साथ अलग - अलग डिब्बों में गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र misfolded प्रोटीन का निर्देशन: घुलनशील प्रोटीन, गिरावट के लिए लक्षित, पाली ubiquitination गुजरना और जू uclear XTA - एन क्यू uality नियंत्रण डिब्बे (JUNQ भेजा जाता है ). सुरक्षात्मक ज़ब्ती के लिए अघुलनशील प्रोटीन कि ubiquitinated नहीं किया जा सकता है मैं nsoluble otein पीआर डी (आइपॉड) eposit, रिक्तिका करने के लिए निकट, के लिए भेजा जाता है, जहां वे सक्रिय एकत्रीकरण से गुजरना. es.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg / &quot;&gt; चित्रा 2. मॉडलिंग GFP-Ubc9 टीएस के साथ प्रोटीन misfolding. सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत, GFP-Ubc9 टीएस (हरा) natively, मुड़ा है और diffusely नाभिक और cytosol में स्थानीयकृत. नाभिक एनएलएस TFP (लाल) द्वारा लेबल है. Ubc9 टीएस की अभिव्यक्ति सभी प्रयोगों में इमेजिंग से पहले 2% ग्लूकोज के अलावा द्वारा बंद किया गया था. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> . <ol><li> तापमान 37 के लिए बदलाव होने पर डिग्री सेल्सियस, GFP-Ubc9 टीएस (हरा) और misfolded साइटोसोलिक तनाव foci रूपों. नाभिक एनएलएस TFP (लाल) द्वारा लेबल है. </li><li> GFP-thermally denaturated Ubc9 टीएस गर्मी सदमे से 23 डिग्री सेल्सियस, वसूली पर पदावनत है, के रूप में कम प्रतिदीप्ति स्तर से संकेत. </li><li> 80 MG132 मम, GFP-U के साथ तापमान 37 डिग्री सेल्सियस और एंटीबॉडी निषेध बदलाव पर<html> bc9 ts misfolded और JUNQ और आइपॉड inclusions में संसाधित. नाभिक एनएलएस TFP (लाल) द्वारा लेबल है. </li><li> तापमान 37 के लिए बदलाव पर ° C और ubiquitination निषेध, GFP-Ubc9 टीएस misfolded है और आइपॉड शामिल किए जाने में संसाधित. नाभिक एनएलएस TFP (लाल) द्वारा लेबल है. Ubiquitin Protease 4 (Ubp4) लिए Ubc9 टीएस ubiquitination ब्लॉक overexpressed है. </li></ol><img alt="चित्रा 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> चित्रा 3. के समय तापमान 37 के लिए बदलाव JUNQ और आइपॉड गठन पर चूक डिग्री सेल्सियस और 80 MG132 मिमी के साथ एंटीबॉडी निषेध, GFP-Ubc9 टीएस तनाव foci JUNQ और आइपॉड inclusions में कार्रवाई कर रहे हैं. नाभिक एनएलएस TFP (लाल) द्वारा लेबल है. 3 डी छवियों 4 मिनट के अंतराल पर हासिल किया गया. (1 मूवी देखें).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;लक्ष्य =&quot;&gt; _blank &quot;बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

सेलुलर व्यवहार्यता प्रोटीन misfolding के समय और कुशल प्रबंधन पर निर्भर करता है. Refolding, गिरावट, या inclusions में ज़ब्ती: यहाँ हम एक misfolded प्रोटीन के विभिन्न संभावित भाग्य visualizing के लिए एक विधि का वर्णन है. हम एक तह सेंसर के उपयोग के प्रदर्शन, Ubc9<sup&gt; टीएस</sup&gt; निगरानी Proteostasis और एकत्रीकरण रहते 4D माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं में गुणवत्ता नियंत्रण के लिए.

4D जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन एकत्रीकरण की इमेजिंग

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