Name: 4d imaging of protein aggregation in live cells
Uploaded: 2013-04-05T12:00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells at JoVE.com

1. Gjær Forberedelser <ol><li> Transform gjærstammer med et plasmid som bærer en GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ts) kassett. </li><li> Grow gjæren i syntetiske medier inneholdende 2% raffinose i 24 timer og tilbake fortynnet til 2% galactose inneholdende medier i 16 timer eller O / N. Inkuber cellene ved 30 ° C mens risting ved 200 rpm. </li><li> Følgende morgen, fortynne spørringen belastning for OD 600 = 0,2. Rist i 4-6 timer ved 30 ° C (200 rpm) inntil kulturen når OD 600 = 0,8 til 1,0. </li><li> Å undertrykke uttrykk (slik som å overvåke bare den allerede oversatt og brettet pool av GFP-Ubc9 ts), endre medier til syntetiske medier supplert med 2% glukose (SD) 30 min før bildebehandling. </li><li> Behandling - varmesjokk cellene i 20 min ved 37 ° C for å indusere misfolding, eller kontinuerlig i mikroskop kuvøse følge proteinaggregering i varmesjokk-betingelser. Notat - Hvis du bruker mikroskopet ved alle temperaturer over RT, pre-heat for om 2 hr ekvilibrere temperaturen langs legemet av mikroskopet og målene (se nedenfor). </li></ol> 2. Plate \ Slide Forberedelser <ol><li> Velg aktuell plate. Det viktigste hensynet er evnen til å opprettholde fokus under bildebehandling oppkjøpet. Følgende punkter er kritisk for 4D bildebehandling og ikke for 2D tid faller bort eller 3D avbildning. <ol><li> Multippel brønner plate-bunnen av de forskjellige brønner kan ikke være homogen (dvs. brønner vil være på forskjellige høyder i forhold til målet). Dette vil gjøre det vanskelig å opprettholde fokus på tvers xy poeng og tidspunkter, uavhengig av autofokusens teknikken som brukes. </li><li> Slide materiale: glass vs plast. Glassbunn lysbildene er mer z-homogen mellom brønner, men er dyrere. </li><li> Tykkelsen på platen bunn: vi vanligvis bruker dekkglass-bunnplater indeksen 1,5, men indeks 1 er også akseptabelt avhengig målet. </li></ol></li><li> Coveh bunnen av platen \ lysbildet med ConA (0,25 mg / ml) i 10 min. ConA blir brukes til å følge celler til lysbildet, som muliggjør å følge en enkelt celle over tid. </li><li> Fjern ConA og inkuber lysbildet i en kjemisk hette, slik at overflødig ConA vil fordampe. </li><li> Plate 200 ul gjær sample (OD 600 = 0,5) i den ConAed godt. </li><li> Inkuber i 15 min, som å aktivere celler feste seg på overflaten av platen. </li><li> Pakk mediet, og vask tre ganger med nytt medium for å få et lag av celler. Merk: Hvis en lang tid forfalle er planlagt, frø cellene tynt slik at nye knopper ikke vil fylle og avbryte region av interesse. </li></ol> 3. Mikroskop Forberedelser <ol><li> Vi bruker et Nikon A1Rsi confocal mikroskop med noen ikke-standard modifikasjoner. For gjær bildebehandling bruker vi opptil 4 lasere (405 nm, 50 mW CUBE laser, 457-514 nm, 65 mW Argon Ion laser, 561 nm, 50 mW Sapphire laser, og 640 nm, 40 mW CUBE laser), og opp til 4 PMTs utstyrt medfiltre. De fleste av imaging vår er gjort med et grønt filter sett for EGFP og et rødt filter sett for mCherry og tdTomato. Med GFP og mCherry det er nesten ingen bleedthrough, derfor vi ofte bruker samtidig skanning. Imidlertid kan linje-skanning også brukes til å hindre bleedthrough når det forekommer. Vår confocal er også utstyrt med en PInano Piezo stadium (MCL), noe som kan gjøre tre msek trinn i z, slik at 2-3 z-stabler (30-50 seksjoner) per sekund. Systemene har også en spektral detektor, Perfect Focus (laser offset), og to skannere - en Galvano skanner og en resonant skanner. </li><li> Velg riktig mål. Hovedhensyn: <ol><li> Vann / olje / luft Mål: viktigste hensyn er brytningsindeksen for det bildedannende medium vs mediet av prøven. <ol><li> Olje objektive fordeler: <ol><li> Olje mål kan ha høyere numeriske blenderåpninger (olje pauser lys mer enn vann, og derfor flere fotoner gå tilbake til målet). Olje mål kan ha opptil 1,49 NA, mot 1,27 for vann. (Men dette er ikke egentlig en stor forskjell i oppløsning). </li><li> Brytningsindeksen for olje tilsvarer brytningsindeksen for glass, derfor ingen fotoner er tapt går fra prøven, gjennom glasset, til målet. (Merk - valgte en nedsenking olje som har en brytningsindeks som passer for dine mål og din dekkglasset). </li><li> Olje gir problemfri gratis lang tid-bortfaller siden den ikke fordamper. </li></ol> Olje Mål ulemper: <ol><li> Jo høyere oppløsning aktivert av høyere NA av olje mål forringer raskt hvis lyset har å reise gjennom et vandig medium (for eksempel en celle). </li><li> Bilder har vanligvis mer sfæriske avvik og en &quot;strukket ut&quot; effekt i 3D. </li><li> Olje er klebrig, rotete, og en fare for mål. </li></ol></li><li> Vann objektive fordeler <ol><li> Cellen selv er vandig, derfor det er færre skjevheter i Z, ennd oppløsningen er fortsatt høy dypt inn i en vandig prøve. </li><li> Rengjør og brukervennlig. Vann objektive ulemper: fordamper raskt, derfor ikke egnet for lange filmer uten særordninger blir gjort for å pumpe vann kontinuerlig til målet. </li></ol></li><li> Air objektive fordeler: 1. Ingen vesentlige er tapt / fordamper under flerpunktskontakt oppkjøp eller en lang film. 2. Rengjør og brukervennlig. Ulempe: lav oppløsning og lav signal følsomhet. </li></ol></li><li> Rom og inkubator temperatur: skiftende temperatur påvirker materie egenskaper, og i delikate systemer endrer fokus. Temperaturen bør justeres før du velger poeng for oppkjøpet. Endre temperaturen under oppkjøpet vil forstyrre bildebehandling og vil resultere i tap av fokus. Vi la vårt mikroskop system ekvilibrere i 2 timer ved den ønskede temperatur før avbildning. </li><li> Korreksjon krage: Mange mål kommer med en korreksjon ring slikmålet å bli justert for en gitt deksel-slip tykkelse. Vi anbefaler å justere korreksjon krage mens du bruker fluorescerende perler å visualisere punkt spredt funksjonen. Dette vil sikre riktige innstillinger for hver prøve. </li><li> Stabile prøve holdere: vi finner at de fleste kommersielt tilgjengelige utvalget holdere er den svakeste delen av mikroskop. De er ofte ustø og ikke rett. Dette er en katastrofe for høy oppløsning, multi-point 4D bildebehandling. Vi designer våre egne eksempler holdere som er rett og passe tett inn på scenen. De kan også være skrudd ved behov. </li><li> Multi-point oppkjøpet: vår imaging system er utstyrt med Nikon &quot;Perfect fokus&quot; system, som er utgangspunktet en laser-baserte autofokus mekanisme. Imidlertid er autofokusering ikke nødvendigvis nødvendig med 4D bildebehandling, spesielt hvis systemet ikke drive mye. </li></ol></li></ol> 4. Imaging <ol><li> Slå på systemet: lasere, scene, controller, kamera og dat.ter programvare. </li><li> Sett platen på scenen holder, forsvarlig sikret og stabilisert. </li><li> Bruk øye port for å bestemme lokalisering og orientering av gjær. </li><li> Bruke lysfelt, vurdere celle helse og levedyktighet i henhold til form og tekstur. </li><li> Slå på epifluorescent lys i henhold til den aktuelle fluoroforen (f.eks FITC filter for GFP), og fokusere på celler som viser fenotypen som er gjenstand for forskning. Celler som er sterkt fluorescerende i mer enn en bølgelengde kan være død og derfor autofluorescent. Vi visualiserer kjernen med en tdTomato fluorofor smeltet til en SV40 NLS signal (NLS-TFP). TFP er dobbelt så stort som GFP, og er derfor over diffusjon grensen av kjernen, derfor det fungerer veldig bra som en kjernefysisk markør. Vi kan også opphisse TFP med en grønn (488 nm) laser samtidig som GFP, men samle den grønne og røde utslipp i to separate PMTs for spektral oppløsning. </li><li> Juster følgende innstillinger for å redusere støyog oversaturation: <ol><li> Laser makt - fotobleking og fototoksisitet vs lysstyrken i bildet bør vurderes. </li><li> Gevinst: påvirker kameraets følsomhet, og dermed signal til støyforhold. </li><li> Pinhole diameter - bør justeres i henhold til laser med kortere bølgelengde. Pinhole diameter bestemmer tykkelsen (høyden) av den optiske delen avbildes. Dermed vil åpne pinhole samle mer lys (la flere fotoner i), men vil redusere oppløsningen i z (mindre confocality). </li></ol></li><li> Nyttige tips: <ol><li> Hvis forskjellige fluoroforer avgir sammenfallende bølgelengde, kan du bruke Spectral Detector funksjon som gjør valget av virtuelle filtre. Husk at spektrale detektorer er mindre følsom enn vanlige PMTs. </li><li> Dersom ulike fluoroforer er begeistret av den samme laseren, bruker linjen skanning funksjonen. </li><li> En Galvano scanner gir mer følsomhet, men har en høyere risiko for photobleaching. En Resonant skanner muliggjør raskere encquisition, og dermed senke risikoen for photobleaching, men er mindre følsom. </li><li> Gjennomsnitt mellom 2 og 16 bilder, forbedrer det signal til støyforhold, men gjør anskaffelse tregere og, selvfølgelig, innebærer mer eksponering av prøven til laseren. </li><li> Varighet av oppkjøp avhenger biologiske spørsmål (f.eks JUNQ og IPOD formasjon tar ~ 2 timer). Vi har tatt bilder gjær med resonans skanner for opp til 30 timer i 3D time-lapse. </li><li> Repeterte intervaller-Mindre mellomrom vil skape en mer helhetlig film, men kan føre til fotobleking og derfor tap av signal. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gershenson, A., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+in+the+cell:+challenges+and+progress.">Protein folding in the cell: challenges and progress.</a> Current opinion in structural biology. 21, 32-41 (2011).</li><li>Aguzzi, A., Calella, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions:+protein+aggregation+and+infectious+diseases.">Prions: protein aggregation and infectious diseases.</a> Physiological reviews. 89, 1105-1152 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteotoxic+stress+and+inducible+chaperone+networks+in+neurodegenerative+disease+and+aging.">Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging.</a> Genes &amp; development. 22, 1427-14 (2008).</li><li>Cohen, E., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+paradox:+aging,+proteotoxicity+and+neurodegeneration.">The insulin paradox: aging, proteotoxicity and neurodegeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. , (2008).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, (1998).</li><li>Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+for+controlling+protein+aggregation.+Nature+reviews.">Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 11, 777-788 (2010).</li><li>Treusch, S., Cyr, D. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposits:+Protection+against+toxic+protein+species?.">Amyloid deposits: Protection against toxic protein species?.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex.). 8, 1668-1674 (2009).</li><li>Spokoini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confinement+to+Organelle-Associated+Inclusion+Structures+Mediates+Asymmetric+Inheritance+of+Aggregated+Protein+in+Budding+Yeast.">Confinement to Organelle-Associated Inclusion Structures Mediates Asymmetric Inheritance of Aggregated Protein in Budding Yeast.</a> Cell Rep. , (2012).</li><li>Weisberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+superoxide+dismutase+1+(SOD1G93A)+aggregates+determines+their+toxicity.">Compartmentalization of superoxide dismutase 1 (SOD1G93A) aggregates determines their toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15811-15816 (2012).</li><li>Kaganovich, D., Kopito, R., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misfolded+proteins+partition+between+two+distinct+quality+control+compartments.">Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments.</a> Nature. 454, 1088 (2008).</li><li>Betting, J., Seufert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+Ubc9+mutant+protein+with+temperature-sensitive+in+vivo+function+is+subject+to+conditional+proteolysis+by+a+ubiquitin-+and+proteasome-dependent+pathway.">A yeast Ubc9 mutant protein with temperature-sensitive in vivo function is subject to conditional proteolysis by a ubiquitin- and proteasome-dependent pathway.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 25790 (1996).</li><li>Tongaonkar, P., Beck, K., Shinde, U. P., Madura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+temperature-sensitive+mutant+of+a+ubiquitin-conjugating+enzyme+and+its+use+as+a+heat-inducible+degradation+signal.">Characterization of a temperature-sensitive mutant of a ubiquitin-conjugating enzyme and its use as a heat-inducible degradation signal.</a> Analytical biochemistry. 272, 263 (1999).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Våre intuisjon om biokjemiske prosesser utlede fra benk topp eksperimenter hvor en godt blandet løsning av reaktanter og produkter er tillatt å nå likevekt i et begerglass. I et slikt miljø, kan konsentrasjonen av en gitt kjemisk art uttrykkes som et enkelt tall, som er forholdet av en molar mengde av molekyler i et makroskopisk volum. Mye av det vi vet om protein struktur og funksjon stammer fra bruk av metoder som gjenspeiler den klassiske, bulk reaksjon bilde: vestlige blotter, sentrifugering, og spektrofotometriske målinger utført på utdrag fra homogenater av hele populasjoner av celler. Som teknologien vi bruker for å se på celler under forstørrelse øker i store sprang, blir det stadig tydeligere at forholdene der de fleste biokjemiske reaksjoner finner sted in vivo bærer bare den minste likhet med de av den klassiske benken toppen scenario. Ikke bare er det indre av cella tettpakket miljø, der samles effekter store forandringer av aktiviteter av ulike reaktanter, er det også helt motsatt av godt blandet. Dette utgjør den hyppige misforhold mellom in vitro og in vivo effektiviteten av et bredt spekter av komplekse makromolekylære reaksjoner. Ingensteds er intuisjoner som stammer fra klassisk in vitro biokjemiske eksperimenter mer utsatt for å villede som i spørsmål knyttet til in vivo folding, misfolding, og aggregering av proteiner. Mens studier av protein kjemi i bulk reaksjoner kan behandle spørsmålet om folding for et gitt protein som et enkelt ja eller nei spørsmål, må ethvert forsøk på å spore dynamikken i hele populasjoner av makromolekyler i en levende celle være følsomme for hele fordelingen av mulige konformasjonsforandringer utfall tilgjengelige til en polypeptidkjede, og særlig risiko for misfolding og aggregering. For eksempel kan vi undersøke en bulk celle lysate av en aggregering protein av vestlige blotting, og fastslår at proteinet er for det meste uløselig og ikke ubiquitinated. Men i den levende celle en diskret subpopulasjon av proteinet, vanskeligere å avdekke når midling over mange celler, kan være oppløselige og ubiquitinated i en bestemt kammer hvor den lokale konsentrasjon av artene er ekstremt høy. Sistnevnte scenario kan ha flere viktige konsekvenser for levedyktigheten av cellen enn den større bulk subpopulasjon. Videre, mens anstand vise en rekke mitogen atferd og funksjoner i vitro, blir det tydelig at i cellen sin diskrete funksjoner er romlig og tidsmessig begrenset. I de nylig dannede paradigme for forstå biokjemi, blir konsentrasjon en variabel for hvert spesifikke nano-miljøet i cellen, og de molekylære hendelser som ligger til grunn biologiske prosesser må analyseres ikke bare i tid, men også i space. 4D imaging tilnærming presenteres her muliggjør følsom modellering av protein misfolding i levende celler, selv om det kan brukes til å studere en rekke andre biologiske prosesser og hvordan de er regulert i rom, tid, og som følge av endringer i omgivelsene. I denne artikkelen bruker vi Ubc9 ts folding sensor, som effektivt viser stadier og alternativer for å håndtere utbruddet av protein aggregering i cytosol. I tillegg til å illustrere den cellebiologi aggregeringsnivå kvalitetskontroll kan denne tilnærmingen tjene som et kraftig verktøy for å tyde virkningen av bestemte forstyrrelser eller genetiske mutasjoner på proteostasis (f.eks Ubc9 ts kan brukes til å måle protein folding stresseffekten oksidasjon, ekspresjonen av en giftig aggregat, eller mutasjoner i kvalitetskontroll reaksjonsveien). 4D bildebehandling er også avgjørende for nøyaktig bestemmelse protein lokalisering eller colocalization mellom to ulike proteins, og for detektering fenomener som kanskje være forbigående, men viktig. For eksempel, spesielt i en liten rund organisme som gjær, kan det synes å være slik at en struktur eller samlet har juxtanuclear lokalisering, mens 4D bildebehandling kan avsløre at dette er rett og slett en gjenstand av vinkelen inspeksjon. I eksemplet eksperimentet vi presenterer her, demonstrerer vi bruk av en modell misfolded protein, Ubc9 ts, å følge aggregering kvalitetskontroll over tid og sted i cytosolen. Ved den permissive temperaturen, blir Ubc9 ts foldet og diffundert i cellekjernen og cytosol. Ved varme-indusert misfolding, danner det utgangspunktet raskt spre små aggregerte Stress Foci som behandles for proteasomal degradering. Når proteasome er delvis hemmet, er disse Stress Foci konvertert til JUNQ og IPOD inneslutninger i løpet av ca 2 timer. Hvis ubiquitin-mediert nedbrytning er ikke tilgjengelig som en kvalitetskontroll alternativet, Ubc9 ts umiddelbart omdirigert til IPOD inkludering for beskyttende aggregering. Disse verktøyene gir utrolige muligheter til å oppdage nye genetiske faktorer involvert i aggregering kvalitetskontroll, og å utforske deres romlige og tidsmessige regulering i cellen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>mbs474790</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>con A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom plates</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>ibd81158</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation 
			Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d imaging of protein aggregation in live cells

En av de viktigste oppgavene for enhver levende celle er å opprettholde riktig folding av nysyntetiserte proteiner i møte med stadig skiftende miljøforhold og en intracellulær miljø som er tett pakket, klebrig, og farlige til protein stabilitet 1. Muligheten til å dynamisk balansere protein produksjon, folding og degradering krever høyt spesialisert kvalitetskontroll maskiner, som har absolutt nødvendighet er observert best når det svikter. Sykdommer som ALS, Alzheimers, Parkinsons, og visse former for Cystisk fibrose har en direkte kobling til protein folding kvalitetskontroll komponenter 2, og derfor fremtidig terapeutisk utvikling krever en grunnleggende forståelse av underliggende prosesser. Vår eksperimentelle utfordring er å forstå hvordan celler integrere skader signaler og montere svar som er skreddersydd for ulike forhold. Den primære grunnen til at protein misfolding representerer en eksistensiell threpå til cellen er tilbøyelighet av feil foldet proteiner til aggregat, og dermed forårsaker en global forstyrrelse av overfylt og delikat intracellulær folding miljø 1. Den sammenleggbare helse, eller &quot;proteostasis,&quot; av den cellulære proteomet opprettholdes, selv under press av aldring, stress og oksidativ skade ved koordinert handling av ulike mekanistiske enheter i en forseggjort kvalitetssystem 3,4. En spesialisert maskineri av molekylære anstand kan binde ikke-innfødte polypeptider og fremme deres folding i naturlig tilstand 1, målrette dem for nedbrytning av ubiquitin-proteasome system 5, eller henvise dem til beskyttende aggregering inneslutninger 6-9. I eukaryoter, er cytosoliske aggregering kvalitetskontroll belastningen fordelt mellom to kamrene 8-10: den juxtanuclear kvalitetskontroll kupé (JUNQ) og det uoppløselige protein innskudd (IPOD) (figur 1 - modell).Proteiner som er ubiquitinmolekyler av proteinfolding kvalitetskontroll maskiner leveres til JUNQ, hvor de blir behandlet for nedbrytning ved proteasomet. Misfolded proteiner som ikke ubiquitinmolekyler viderekobles til IPOD, hvor de aktivt samlet i en beskyttende lomme. Frem til dette punktet har den metodiske paradigmet av live-cell fluorescensmikroskopi i stor grad vært å merke proteiner og spore sine steder i cellen på bestemte tidspunkter og vanligvis i to dimensjoner. Som ny teknologi har begynt å gi forskere enestående tilgang til submikron skala i levende celler, har den dynamiske arkitektur cytosol komme til syne som en utfordrende ny grense for eksperimentell karakterisering. Vi presenterer en fremgangsmåte for raskt å overvåke 3D romlige fordelinger av flere fluorescensmerkede proteiner i gjær cytosol over tid. 3D timelapse (4D imaging) er ikke bare en teknisk utfordring, rottehenne, det forenkler også en dramatisk endring i det konseptuelle rammeverket brukes til å analysere cellestruktur. Vi bruker et cytosoliske folding sensor protein i levende gjær å visualisere forskjellige skjebner for misfolded proteiner i mobilnettet aggregering kvalitetskontroll, ved hjelp av rask 4D fluorescerende imaging. Den temperaturfølsomme mutant av den Ubc9 proteinet 10-12 (Ubc9 ts) er ekstremt effektiv både som en sensor av mobilnettet proteostasis, og en fysiologisk modell for sporing aggregering kvalitetskontroll. Som med de fleste ts proteiner, er Ubc9 ts fullt foldet og funksjonelle ettergivende temperaturer på grunn av aktive cellulære anstand. Over 30 ° C, eller når cellen ansikter misfolding stress, Ubc9 ts misfolds og følger skjebnen til en innfødt globular protein som har blitt misfolded grunn mutasjon, varme denaturering, eller oksidativ skade. Ved å fusjonere det til GFP eller andre fluoroforer, kan det spores i 3D som den danner Stress Foci, eller er dirigeres til JUNQ eller iPod.

<html><img alt="Figur 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> Figur 1. Modell:. Sub-mobilnettet compartmentalization av misfolded proteiner Kvalitetskontroll maskiner dirigerer misfolded proteiner inn i forskjellige rom med forskjellige funksjoner: Løselig proteiner, målrettet for nedbrytning, gjennomgår poly-ubiquitinering og blir sendt til Ju XTA-N uclear Q uality kontroll rom (JUNQ ). Uløselig proteiner som ikke kan ubiquitinmolekyler blir sendt for beskyttende håndtering til jeg nsoluble Pr otein D eposit (iPod), ved siden av vakuole, der de gjennomgår aktive aggregering. es.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. Modellering protein misfolding med GFP-Ubc9 ts. Under normale forhold, er GFP-Ubc9 ts (grønn) opprinnelig kastet, og er lokalisert diffust i kjernen og cytosol. Kjernen er merket av NLS-TFP (rød). Uttrykk av Ubc9 ts ble stengt av ved tillegg av 2% glukose før bildebehandling i alle forsøk. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <ol><li> Ved temperatur skift til 37 ° C, GFP-Ubc9 ts (grønn) misfolded og danner cytosoliske Stress Foci. Kjernen er merket av NLS-TFP (rød). </li><li> Ved utvinning fra varmesjokk ved 23 ° C, termisk denaturert GFP-Ubc9 ts er degradert, som indikert av redusert fluorescens nivå. </li><li> Ved temperatur skift til 37 ° C og proteasomhemmingen med 80 mm MG132, GFP-U<html> bc9 ts er misfolded og behandles i JUNQ og IPOD inneslutninger. Kjernen er merket av NLS-TFP (rød). </li><li> Ved temperatur skift til 37 ° C og ubiquitinering hemming, er GFP-Ubc9 ts misfolded og bearbeidet til IPOD inkludering. Kjernen er merket av NLS-TFP (rød). Den Ubiquitin Protease 4 (Ubp4) er overexpressed å blokkere Ubc9 ts ubiquitinering. </li></ol><img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> Figur 3. Tidsforløp av JUNQ og IPOD formasjon. Ved temperatur skift til 37 ° C og proteasomhemmingen med 80 mm MG132, er GFP-Ubc9 ts Stress Foci behandlet i JUNQ og IPOD inneslutninger. Kjernen er merket av NLS-TFP (rød). 3D-bilder ble kjøpt til fire minutters mellomrom. (Se også Movie 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se større figur.

Watch this Scientific Journal Video about 4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells at JoVE.com

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Cellular levedyktighet avhenger rettidig og effektiv styring av protein misfolding. Her beskriver vi en metode for å visualisere de ulike potensielle skjebner i en misfolded protein: refolding, fornedrelse, eller håndtering i inneslutninger. Vi viser bruk av en sammenleggbar sensor, Ubc9<sup&gt; Ts</sup&gt; For overvåking proteostasis og aggregering kvalitetskontroll i levende celler ved hjelp 4D mikroskopi.

4D Imaging of Protein Aggregation i levende celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Gransker Protein-protein interaksjoner i levende celler ved hjelp Bioluminesens Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

In Vitro Aggregation Analyser hjelp hyperfosforylert Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brukergrensesnitt for programvareassistert sporing av proteinkonsentrasjon i dynamiske cellulære protrusjoner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder for å studere endringer i iboende Protein samling med alder i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

4D Microscopy of Yeast

4D mikroskopi av gjær

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

FLIM-FRET Målinger av protein-protein interaksjoner i levende bakterier.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...