Name: preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy at JoVE.com

著者らは、ポリICLCの贈り物のためにアンドレスサラザール（Oncovir株）に感謝したいと思います。

1。 PBMCを4の単離と凍結保存<ol><li>無菌スパイクプラズマ転送セットを使用して、白血球搬出袋のアクセスポートのいずれ。 60ミリリットル注射器を用いて、無菌の500mlボトルに患者から得られた白血球搬出を転送する。 </li><li>室温RPMIを用いて元のボリュームを2倍に白血球搬出の音量を調整します。徹底的に混ぜる。 </li><li>優しくフィコール - Paque PLUSのボトルを混ぜて。滅菌50ミ?...

<ol>
	<li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+vaccines+in+melanoma:+from+promise+to+proof.">Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).</li><li>Sabado, R. L., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+dendritic+cell+immunotherapy+towards+successful+cancer+treatment.">Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment.</a> Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).</li><li>Schumacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keyhole+limpet+hemocyanin+(KLH)+conjugate+vaccines+as+novel+therapeutic+tools+in+malignant+disorders.">Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).</li><li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient.">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).</li><li>Eichler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+study+on+in+vitro+characterization+of+dendritic+cells.">Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells.</a> Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).</li><li>Feuerstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+cryopreserved+aliquots+of+antigen-preloaded,+mature+dendritic+cells+ready+for+clinical+use.">A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use.</a> J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).</li><li>O'Neill, D., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+autologous+peptide-+and+protein-pulsed+dendritic+cells+for+patient-specific+immunotherapy.">Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy.</a> Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).</li><li>de Vries, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypical+and+functional+characterization+of+clinical+grade+dendritic+cells.">Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells.</a> J. Immunother. 25, 429-438 (2002).</li><li>Jonuleit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+cytokines+and+prostaglandins+induce+maturation+of+potent+immunostimulatory+dendritic+cells+under+fetal+calf+serum-free+conditions.">Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.</a> Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).</li><li>Lee, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+grade+cocktail+of+cytokines+and+PGE2+results+in+uniform+maturation+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells:+implications+for+immunotherapy.">A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy.</a> Vaccine. 20, A8-A22 (2002).</li><li>Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+immune+system+to+treat+cancer.">Harnessing the immune system to treat cancer.</a> J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).</li><li>Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+agonists:+are+they+good+adjuvants?.">Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?.</a> Cancer J. 16, 382-391 (2010).</li><li>Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+dominance,+competition+and+T+cell+affinity+maturation.">Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation.</a> Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).</li><li>Bogunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR4+engagement+during+TLR3-induced+proinflammatory+signaling+in+dendritic+cells+promotes+IL-10-mediated+suppression+of+antitumor+immunity.">TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity.</a> Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).</li><li>Verdijk, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyriboinosinic+polyribocytidylic+acid+(poly(I:C))+induces+stable+maturation+of+functionally+active+human+dendritic+cells.">Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells.</a> J. Immunol. 163, 57-61 (1999).</li><li>Rouas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(I:C)+used+for+human+dendritic+cell+maturation+preserves+their+ability+to+secondarily+secrete+bioactive+IL-12.">Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12.</a> Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).</li><li>Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th1-polarizing+capacity+of+clinical-grade+dendritic+cells+is+triggered+by+Ribomunyl+but+is+compromised+by+PGE2:+the+importance+of+maturation+cocktails.">Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails.</a> J. Immunother. 28, 480-487 (2005).</li><li>Krause, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+is+a+key+factor+for+monocyte-derived+dendritic+cell+maturation:+enhanced+T+cell+stimulatory+capacity+despite+IDO.">Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO.</a> J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).</li><li>Morelli, A. E., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+under+the+spell+of+prostaglandins.">Dendritic cells under the spell of prostaglandins.</a> Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).</li><li>Adams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+(DC)+based+therapy+for+cervical+cancer:+use+of+DC+pulsed+with+tumour+lysate+and+matured+with+a+novel+synthetic+clinically+non-toxic+double+stranded+RNA+analogue+poly+[I]:poly+[C(12)U]+(Ampligen+R).">Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R).</a> Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).</li><li>Colombo, M. P., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-12+in+anti-tumor+immunity+and+immunotherapy.">Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).</li><li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity.">Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).</li><li>Dhodapkar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+broad+T-cell+immunity+in+humans+after+a+single+injection+of+mature+dendritic+cells.">Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells.</a> J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).</li><li>Schuler-Thurner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+tumor-specific+type+1+T+helper+cells+in+metastatic+melanoma+patients+by+vaccination+with+mature,+cryopreserved,+peptide-loaded+monocyte-derived+dendritic+cells.">Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells.</a> J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).</li></ol>

フェーズIおよびIIは、単球由来樹状細胞の臨床試験は、患者しかしながら、臨床的成功は1に限定されているにおける免疫応答を誘導することが示されている。これは、腫瘍免疫療法用に最適DCを生成する方法に関するコンセンサスが不足している一因であってもよい。臨床グレードのDCを生成する多数の方法があるが、これらの方法は、単球、成熟を誘導するために使用される刺激、...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td fo:width="2in">Reagent/Supplies/Equipment</td>
 <td>Manufacturer</td>
 <td>Catalog No.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI-1640 medium with L-glutamine</td>
 <td>BioWhittaker</td>
 <td>12-702F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M HEPES buffered saline</td>
 <td>BioWhittaker</td>
 <td>17-737E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
 <td>BioWhittaker</td>
 <td>17-516F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human albumin, 25% solution USP</td>
 <td>Aventis Behring</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5442-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human AB serum</td>
 <td>Valley Biomedical</td>
 <td>HP1022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile saline USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CryoMACS DMSO </td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>170-076-303</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml</td>
 <td>Berlex</td>
 <td>A02266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MACS GMP IL-4</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>170-076-101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml</td>
 <td>Oncovir</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VACMUNE KLH</td>
 <td>Biosyn</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>225 sq cm EasyFlasks</td>
 <td>Nalgene Nunc</td>
 <td>159934</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Falcon 6-well tissue culture plates</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml CryoTube vials</td>
 <td>Nalgene Nunc</td>
 <td>377267</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Controlled Rate Freezer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>CryoMed</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy

臨床研究は、抗原·ロードDCワクチンは腫瘍1のための安全かつ有望な治療法であり、それらの臨床的有効性が確立されて残っていることが確立しているが。方法は、良好な製造技術（GMP）のガイドラインに準拠して作成、後述するように、臨床研究のためのDC 2を大量に生成するための最も一般的なex vivoでの調製方法の最適化である。 提案手法では、樹状細胞を刺激するための合成TLR 3アゴニストポリイノシン - ポリシチジル酸 - ポリ-L-リジンカルボキシメチルセルロース（ポリICLC）を利用する。 CD83およびCD86のアップレギュレーションにより評価されるポリICLCはヒトDCのための最も強力な個々の成熟刺激であることが確立我々の以前の研究では、インターロイキン12の誘導（IL-12）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターフェロンγ誘起タンパク質10（IP-10）、interleukmin 1（IL-1）、I型インターフェロン（IFN）、および最小のインターロイキン10（IL-10）産生。 </p&gt; 樹状細胞は、白血球搬出により得られた凍結末梢血単核細胞（PBMC）から区別される。 PBMCを、フィコール勾配遠心分離によって単離し、アリコートで凍結する。 1日目では、PBMCを解凍され、℃の中の組織培養インキュベーターで、37〜2時間インキュベートした後、プラスチック表面に付着した単球を選択するために組織培養フラスコに播種。インキュベーション後、リンパ球が洗い落とされ、接着単球を未成熟DCに分化するインターロイキン-4（IL-4）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の存在下で5日間培養する。 6日目に、未成熟DCは、ワクチンの品質の制御として機能し、ワクチン3の免疫原性を高めることがキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）タンパク質でパルスされています。 DCは、成熟に刺激ペプチド抗原を搭載し、一晩インキュベートする。 7日目に、細胞を洗浄し、含有する、1mlのアリコートで凍結4 -制御された速度冷凍庫を使って20×10 6細胞。 DCのバッチのロットリリーステストが行​​われ、それらが患者に注入される前に、最低限の仕様を満たしている必要があります。

10との間 - 出発したPBMCの20％は培養期間の終了時にDCへと分化する。成熟DCはあるのCD11c +、CD14-、CD83 +、CD40 +、およびCCR7 +（ 図1）。それらは、MHCクラスIおよびII分子および共刺激分子CD80およびCD86の高いレベルを発現する。他のTLRアゴニスト14と比較して、ポリICLCまた、PDL-1の低レベルを誘導した。さらに、これらのポリIC-成熟DCを分泌する大IL-12の量（ 図2及...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy at JoVE.com

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

腫瘍免疫療法に使用するための自​​己樹状細胞（DC）を大量に生成するための最も一般的に使用される方法が記載されている。この方法は、単球から樹状細胞を区別するためにIL-4およびGM-CSFを使用する。彼らは患者に再び注入される前に、未成熟DCは、成熟した後、抗原でロードに刺激される。

免疫療法のための腫瘍抗原にロードされた成熟樹状細胞の調製

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

マウス肺樹状細胞の分離

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

ケアの膠芽腫の標準のコンテキストにおける養子療法のためのCAR T細胞の生成

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ<em&gt;マイコバクテリウム・ボビス</em&gt;カルメット - ゲラン

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

生理学的免疫原性樹状細胞を生成するための新規プロトコル

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...