Name: combined immunofluorescence and dna fish on 3d-preserved interphase nuclei to study changes in 3d nuclear organization
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить членов Скок лаборатории, особенно Сюзанна Хьюитт, для обсуждения и комментариев. Эта работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS является лейкемия и лимфома ученого общества. JC является членом Irvington Института исследований института рака. MM поддерживается Национального научного фонда грант интегративной последипломного образования и науки Стажировка (NSF IGERT 0333389).

1. ДНК-зонда маркировки с флуорофоры: Nick перевода (~ 6 часов) <ol><li> Чистая BAC ДНК (подготовлен макси-подготовки) или плазмиды или ПЦР-продукты, все ресуспендировали в H 2 O, может быть использована для маркировки. Отметим, что для надежного сигнала FISH, зонды должны занимать не м?...

<ol>
	<li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods in enzymology. , 376-405 (2004).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).</li><li>Markaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+3D-FISH+and+super-resolution+structured+illumination+microscopy+for+studies+of+3D+nuclear+architecture:+3D+structured+illumination+microscopy+of+defined+chromosomal+structures+visualized+by+3D+(immuno)-FISH+opens+new+perspectives+for+studies+of+nuclear+architecture.">The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).</li><li>Heard, E., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+gene+regulation+and+chromosome+territory+organisation.">The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation.</a> Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li><li>Fraser, P., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+the+genome+and+the+potential+for+gene+regulation.">Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation.</a> Nature. 447, 413-417 (2007).</li><li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories--a+functional+nuclear+landscape.">Chromosome territories--a functional nuclear landscape.</a> Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).</li><li>Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+nuclear+bodies.">Biogenesis and function of nuclear bodies.</a> Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).</li><li>Dostie, J., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+organization+in+the+nucleus+-+charting+new+territory+across+the+Hi-Cs.">Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 22, 125-131 (2012).</li><li>van Steensel, B., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+tools+for+unraveling+chromosome+architecture.">Genomics tools for unraveling chromosome architecture.</a> Nature. 28, 1089-1095 (2010).</li><li>Massey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kolmogorov-Smirnov+Test+for+Goodness+of+Fit.">The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit.</a> Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).</li><li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RUNX+transcription+factor-mediated+association+of+Cd4+and+Cd8+enables+coordinate+gene+regulation.">RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation.</a> Immunity. 34, 303-314 (2011).</li><li>Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+interpretation+of+&#967;2+from+contingency+tables,+and+the+calculation+of+P.">On the interpretation of &#967;2 from contingency tables, and the calculation of P.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).</li><li>Benjamini, Y. H., Yosef, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+false+discovery+rate:+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing.">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).</li><li>Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+accessibility,+nuclear+positioning,+recombination,+and+transcription+at+the+Igkappa+locus.">Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus.</a> J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).</li><li>Fuxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax5+induces+V-to-DJ+rearrangements+and+locus+contraction+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene.">Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Genes Dev. 18, 411-422 (2004).</li><li>Goldmit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+ontogeny+of+the+Igk+locus+during+B+cell+development.">Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development.</a> Nature. 6, 198-203 (2005).</li><li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+Igk+and+Igh+immunoglobulin+loci+mediated+by+the+3'+Igk+enhancer+induces+'decontraction'+of+the+Igh+locus+in+pre-B+cells.">Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells.</a> Nature. 9, 396-404 (2008).</li><li>Johnson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+Functionally+Segregates+the+Pro-B+Cell+Stage+by+Regulating+Transcription+of+Recombination+Mediators+across+Cell+Cycle.">IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle.</a> Journal of Immunology. , (2012).</li><li>Karnowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+and+nuclear+repositioning+of+the+lambda5+gene+locus+at+the+pre-b+cell+stage+requires+Aiolos+and+OBF-1.">Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1.</a> PLoS ONE. 3, e3568 (2008).</li><li>Kosak, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnuclear+compartmentalization+of+immunoglobulin+loci+during+lymphocyte+development.">Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development.</a> Science. 296, 158-162 (2002).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+critical+regulator+of+B-cell+development.">Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development.</a> Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).</li><li>Parker, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pre-B-cell+receptor+induces+silencing+of+VpreB+and+lambda5+transcription.">The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription.</a> Embo J. 24, 3895-3905 (2005).</li><li>Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+'decontraction'+and+centromeric+recruitment+contribute+to+allelic+exclusion+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene.">Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Nature immunology. 6, 31-41 (2005).</li><li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequivalent+nuclear+location+of+immunoglobulin+alleles+in+B+lymphocytes.">Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes.</a> Nature. 2, 848-854 (2001).</li><li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+contraction+by+looping+of+the+Tcra+and+Tcrb+loci+in+rearranging+thymocytes.">Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes.</a> Nature immunology. 8, 378-387 (2007).</li><li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location.">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li><li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci.">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li><li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li><li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division.">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+the+histone+guardian+of+the+genome.">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li><li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus.">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li><li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei.">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMX:+a+new+platform+for+multimodal,+multichannel+wide-field+imaging.">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li></ol>

Описанные выше методы были использованы в нашей лаборатории для анализа регулирования V (D) J рекомбинации иммуноглобулинов и TCRA / д локусов в развивающихся лимфоциты 30,31. Мы уверены, что эта техника может быть адаптирована для обнаружения различных ядерных белков, ядерны...

Эпигенетических спусковые механизмы создания и наследования развития и типа клеток конкретной транскрипционных профилей. На одном уровне это связано с модуляцией упаковки хроматина, который определяет активный или тихий регионов генома. В более широком масштабе, глобальной 3D организации генома и ядерных архитектуры также играть роль в контроле транскрипции моделей. Таким образом, рассечение этих эпигеномном функций имеет важное значение для полного понимания того, как гены регулируются 6-11. Комбинированные иммунофлюоресценции и 3D ДНК FISH предоставляет уникальную возможность дополнить молекулярные и биохимические анализы по оценке специфических взаимодействий / ассоциации последовательностей ДНК и / или белков в ядре. Кроме того, в то время как по всему геному высокой пропускной методы, такие как иммунопреципитации хроматина (ChIP-далее) или хромосомы захвата конформации в сочетании с глубоким секвенирования (4C-след, 5C, Привет-C) обеспечивают глобальную DATна клеточных популяций 12, иммунофлюоресценции / ДНК FISH методы анализа позволяют на одном уровне клетки. Здесь мы опишем протокол для одновременного обнаружения модификации гистонов с помощью иммунофлуоресценции и ДНК-последовательностей ДНК FISH последующей 3D-микроскопии и анализа (3D иммуно-FISH). Преимущество этого протокола является комбинированным визуализации ДНК и сохранению белковых структур. Наш опыт в этой области позволил нам усовершенствовать и упростить существующие протоколы. Хотя мы использовали этот протокол для обнаружения ДНК двухцепочечной перерывы в лимфоциты проходят рекомбинации, этот метод может быть применен к другим белков и других клеточных типов.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название Реагенты / Материал </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Рыбак </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> РНКазы </td><td> Сигма </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> дНТФ </td><td> Сигма </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa дУТФ </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 С-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 или Cy5 дУТФ </td><td> Рыбак </td><td> № 45-001-ххх </td><td></td></tr><tr><td> ДНКазы I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> ДНК-Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0,025 мкм фильтры </td><td> Milliporэлектронной </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Детская кроватка-1 ДНК 1 мг / мл </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc ДНК 1 мг / мл </td><td> Прикладной генетики </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> Лосось спермы </td><td> Сигма </td><td> # D1626 </td><td> порошок для ресуспендировали в дозе 10 мг / мл в H 2 O </td></tr><tr><td> NaAc (ацетат натрия, рН 5,2, буферный раствор) </td><td> Сигма </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Молекулярная биология класс) </td><td> Рыбак </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Поливинилпирролидон (Mol Biol класс) </td><td> Рыбак </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Декстран сульфат порошок </td><td> Сигма </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> ГНПП (Saline-фосфат натрия, EDTA) 20x решения </td&gt; <td> Рыбак </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Формамид </td><td> Рыбак </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Покровные </td><td> Рыбак </td><td> № 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Слайды </td><td> Рыбак </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> 6-луночные планшеты </td><td> Рыбак </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> Рыбак </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> Поли-L-лизин решения </td><td> Сигма </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Параформальдегид, гранулы, 95% </td><td> Сигма </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol класса </td><td> Сигма </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (бычий сывороточный альбумин) доля V </td><td> Рыбак </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Нормальной козьей сывороткой </td><td> Vector Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Твин-20, Mol Biol класса </td><td> Сигма </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (солевой раствор цитрата натрия) 20x решения </td><td> Рыбак </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Продлить Золотой реагента antifade </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-диамидино-2-фенилиндол) </td><td> Сигма </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Лучший тест один слой резинового клея </td><td> Магазины Искусство или канцелярских товаров </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Таблица 1. Специфических реагентов и малого оборудования. </td></tr></tbody></table>

combined immunofluorescence and dna fish on 3d-preserved interphase nuclei to study changes in 3d nuclear organization

Флуоресцентные на месте гибридизации с использованием ДНК-зондов на 3-размерной сохранились ядер следуют 3D конфокальной микроскопии (3D ДНК FISH) представляет собой наиболее прямой путь к себе расположение генов локусов, хромосомные суб-регионов или целых территорий в отдельных клетках. Этот тип анализа дает представление о глобальной архитектуре ядра, а также поведение конкретных локусов генома и регионов в ядерном пространстве. Иммунофлюоресценции, с другой стороны, позволяет обнаружения ядерных белков (гистонов изменения, гистонов варианты и модификаторы, транскрипция машин и факторов, ядерных суб-купе и т.д.). Основной проблемой в сочетании иммунофлюоресценции и 3D ДНК рыб, с одной стороны, сохранить эпитопа обнаружены антитела, а также 3D-архитектурой ядра, а с другой стороны, чтобы позволить проникновение ДНК-зонда для обнаружения генных локусов или хромосомных территорий 1-5. Здесь мы предлагаем протокол, который сочетает в себе визуализации хроматина модификации с геномных локусов в 3D сохранил ядер.

ДНК и иммуно-FISH используются в лаборатории Скок для изучения изменений в ядерной организации, связанные с процессом V (D) J рекомбинации локуса рецептора антигена в В-и Т-лимфоцитов развития. Описанные выше методы позволяют я) мера расстояния между двумя концами локус (сжатие) II) для измер...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization at JoVE.com

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Здесь мы опишем протокол для одновременного обнаружения модификации гистонов с помощью иммунофлуоресценции и ДНК-последовательностей ДНК FISH последующей 3D-микроскопии и анализа (3D иммуно-ДНК FISH).

Комбинированные иммунофлуоресценции и ДНК рыб на 3D-сохранена интерфазных ядер для изучения изменений в 3D-ядерный организации

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

ДНК-идентификация видов рыб протокола

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Прочная 3D рыбу ДНК с использованием меченых зондов непосредственно

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Оценка Виды-конкретный вклад в черепно-лицевой развития Использование Перепела-утки химер

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

В сочетании ДНК-РНК Люминесцентная<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация (FISH) по изучению Х-хромосома инактивации в Дифференцированный Женский эмбриональных стволовых клеток мыши

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Измерение повреждения и восстановления ДНК в мышиных спленоцитах После Хронический<em&gt; В Vivo</em&gt; Воздействие Очень низкие дозы бета- и гамма-излучения

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Выделение конкретных областей генома и идентификации Associated молекул enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Методы для изучения изменений в присущих агрегации белков с возрастом у нематоды Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Последовательная иммунофлуоресценция и иммуногистохимия на криосекционированных эмбрионах зебры

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...