Name: live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Vi takker J. Cappellani og J. Qiu for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Cancer Institute (U01 CA141451), den Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen for Cure, Long Island 2 Day Walk to Fight Breast Cancer, Manhasset Dame Coalition Against Breast Cancer til mig, og en præ-ph.d.-stipendium fra Kongressen Instrueret Breast Cancer Research Program, US til ESNESN er også modtageren af ​​Leslie C. Hurtig og William Randolph Hearst Foundation stipendier fra Watson School of Biological Sciences. HAA blev støttet af midler fra Norges Forskningsråd (160698/V40 og 151.882), og sydøstlige regionale sundhedsmyndigheder (2.007.060).

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development.">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li><li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche.">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li><li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor.">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li><li>Breart, B., Lema&#238;tre, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8++T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice.">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li><li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li><li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows.">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL/6J.">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).</li><li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta.">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells.">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med IACUC godkendte protokoller.

Svarene fra tumorer systemiske behandlinger in vivo kan være dramatisk anderledes end kræftceller in vitro, da mikromiljøet påvirker både den akutte respons og tilbagefald 5. En af de største hindringer for explicating in vivo kemoresistens veje er kompleksiteten af samspillet mellem kræftceller og deres mikromiljø. Navnlig, eftersom faste tumorer har udviklet en balance mellem cancer og stromaceller, perturbationer af en komponent, såsom celledød, der opstår under anticancerbehandling kan resultere i dramatiske virkninger på væv organisation. Den intravital billeddannelse teknik gives her giver mulighed for direkte visualisering af kræft celle-stroma interaktioner inden for tumorer i levende, bedøvede mus under behandling med anti-cancer medicin. Vi bruger spinning disk konfokal mikroskopi, som har en relativ begrænset indtrængningsdybde (se 17 </sup&gt;), men vore kirurgiske og mærkning teknikker kan anvendes med andre typer af mikroskopi. Film erhvervet fra disse forsøg, kan anvendes til at spore processer, der omfatter ændringer i fluorescensintensitet (fx på grund af infiltrering af et mærket population eller induktion af celledød), cellemotilitet, fordeling af injicerbare (fx at spore vaskulær lækage), og co- lokalisering af fluorescerende signaler 5,12,17,20. Vi rutinemæssigt billeder mus til over 6 timer og også udført billeddannelse i over 18 timer. Dette kræver opretholdelse af musene kontinuerligt under anæstesi for disse lange tidsperioder. Med korrekt anæstesi, overlever mere end 90% af dyrene 6 timer, og omkring 80% overleve i 18 timer. Nærmere oplysninger om, hvordan du udfører en langsigtet anæstesi er blevet offentliggjort tidligere 19. Det er vores erfaring, er fem faktorer kritiske: undgå hypotermi, undgå dehydrering, opretholde fysiologiske blod iltmætning niveauer, usynge befugtet bæregas til isofluran, og holde dyrene på det laveste niveau af anæstesi, hvor de ikke viser tegn på smerte. For at opretholde kroppens temperatur, vi holder mus under en opvarmet tæppe (ved 38 ° C). For at undgå dehydrering, vi indsprøjte små mængder af saltvand ip hele imaging procedure. For at opretholde fysiologiske blodoxygenmætning niveauer, starter vi med 21% oxygen i bæregassen (snarere end den almindeligt anvendte 100%). Det giver os mulighed for at øge inhalerede ilt niveauer, hvis en mus - timer i et eksperiment - viser et fald i blodets iltmætning. Det er vores erfaring, næsten altid øge inhalerede ilt niveauer på det pågældende tidspunkt (fx til 30-40%) vil stabilisere dyret giver mulighed for timers ekstra billeddannelse. Det optimale niveau af anæstesi er for de fleste mus, der er opnået med 1-1,5% isofluran og resulterer i ånde satser 60-65/min og puls satser 400-450/min. I vores billeddannelse eksperimenter, anvender vi primært transgene mus models (MMTV-PyMT og C3 [1]-Tag), hvor tumorer er multifokal, der giver mulighed for billeddannelse af flere læsioner på forskellige stadier af tumorprogression parallelt på flere x, y-positioner under en enkelt scanning session. Dette reducerer bekymringer med hensyn til muse-til-mus variation for forsøg med henblik på at finde fase-afhængige terapeutiske responser, og reducerer antallet af dyr, der kræves til billeddannelse. Den MMTV-PyMT model (og andre spontane kræftmodeller) går gennem progressive histopatologiske faser, der kan genkendes i løbet af intravital billeddannelse, selv om den patologiske iscenesættelse af tumorlæsioner, der kan gøres i løbet af intravital billeddannelse er forskellig fra, og mindre detaljeret, end det histologiske snit 5,17. I modsætning hertil har tendens transplantation modeller for at afspejle sent stadium tumorer bedst, som cancercellerne sædvanligvis isoleres fra avancerede tumorer. Sådanne modeller er således mere medgørlige at studere tumor-stromainteraktioner mellem sent stadium tumorer end forskelle i disse interaktioner mellem forskellige stadier. Vi viser eksempler på, hvordan billedet nukleare strukturelle ændringer, der opstår efter celledød induceret af behandling. I fravær af anti-cancerbehandling, kan denne mærkning strategi i stedet anvendes til at afbilde celledeling in situ, belyse, for eksempel hvor celleproliferation og vækstdvale påvirkes af mikromiljøet. I fremtiden kan fluorescerende mærkning af mitokondrielle komponenter gør det muligt at afbilde mitokondrielle forandringer, der sker i apoptotisk celledød. I denne protokol, har vi også vist eksempler på, hvordan billedet kræft celle-immune celleinteraktioner efter behandling, men andre microenvironmental komponenter kan også visualiseres og afbildet. Eksisterende transgene reporter linjer til stromale komponenter indbefatter de til fibroblaster (f.eks., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21), eller celler fra vaskulaturen (f.eks Tie2-GFP 22, VEGF-GFP 23). Intravital billedbehandling giver mulighed for real-time visualisering af de interaktioner og processer, der opstår in vivo efter indgift af kemoterapi. Med den teknologi øjeblikket er til rådighed, har vi gjort store fremskridt med at forstå, hvordan myeloide celler påvirker terapeutisk respons, men fordi det tumormikromiljøet er så kompleks, er store fremskridt stadig behov for at begynde at dykke mekanisk ind i processerne bag miljø-medieret resistens. En af de vigtigste fremskridt stadig kræves er identifikationen af ​​bedre markører for specifikke cellepopulationer. Betydningen af ​​bedre markører er godt illustreret med to af de mest fremtrædende stromacellelinier komponenter af brysttumor mikromiljøet, fibroblaster og immunceller. α-glat muskel-actin (αSMA) anvendes ofte til at identificerefibroblaster, men proteinet er også udtrykt af vaskulære glatte muskelceller og myoepitelcellerne 24. Selv αSMA-GFP reporter mus findes, bestemmelse af specifik celletype er således under en intravital imaging eksperiment er udfordrende. Ligeledes vil en enkelt fluorescerende markør, såsom EGFP udtrykt under c-fms-promotoren identificerer ofte flere subpopulationer af immunceller 12,17. Således, selv om man ideelt set gerne vil bruge en enkelt markør for at identificere en specifik celletype kompleksiteten af ​​den underliggende biologi er en stor udfordring i at bruge denne fremgangsmåde. En delvis løsning på dette problem er at anvende injicerbare etiketter til yderligere at skelne subpopulationer af celler, der udtrykker det samme fluorescerende reporter. For eksempel er fluorescerende dextraner optages af makrofager og kan anvendes til at mærke de makrofag-subpopulationer, der er mærket af c-fms-EGFP og Fsp1-EGFP transgene reporter mus <sup&gt; 17. Antistoffer konjugeret til fluorescerende prober er også blevet anvendt til at identificere specifikke undergrupper (f.eks GR1-positive population af myeloide celler mærket med c-fms-EGFP reporter 17). I modsætning tumor responskurver genereret af caliper måling, som giver ringe mekanistisk oplysninger om, hvordan eller hvorfor tumorer reagerer på den indgivne terapeutiske eller histologisk serie afledt fra væv høstet på forskellige tidspunkter, som kræver store mængder af dyr, tilvejebringer vor teknik direkte, kvantificerbar oplysninger på dynamikken i celledød og om eventuelle vekselvirkninger med stromaceller med kræftceller i små årgange. Således fordelen ved at anvende fremgangsmåden beskrevet her er, at den tilvejebringer dynamisk information om lægemiddel-respons i forbindelse med et intakt tumor-mikromiljøet i realtid. Sådanne oplysninger kan føre til vigtige indsigter i de underliggende processer, der driver terapeutiske respons 5 &lt;/ Sup&gt;.

Solide tumorer består af to store rum: kræft celler og de ​​stromale bestanddele (både cellulær og ikke-cellulær), der medvirker til at bevare et passende miljø for tumorvækst 1. Disse stromale bestanddele spiller afgørende roller i udvikling, progression og metastasering af mange typer af kræft, herunder i brystet 2-5. Det stromale miljø påvirker også terapeutiske responser 2,4,5. Således, at bestemme, hvor cancerceller reagerer på konventionelle og nye behandlingsformer i forbindelse med det intakte mikromiljø er vigtigt for at fremme vores forståelse af cancer biologi og forbedring af nuværende terapeutiske strategier. Desuden definerer, hvordan kræft celle-stroma interaktioner ændre sig efter administration af behandling er afgørende for at forstå biologi tumor tilbagefald. Organotypiske co-dyrkning systemer har været anvendelige til at studere tumor-stroma interaktion <sop&gt; 6, men det er klart, at fremgangsmåderne tiden tilgængelige ikke med succes kan gentage den intakte tumormikromiljøet in vitro, navnlig med hensyn til vaskulær funktion og immunceller. Faktisk cancer celle-reaktioner på behandlinger, der observeres in vitro, er ofte væsentligt forskellige fra dem, der ses in vivo, hvor mikromiljøet er intakte 5. Således kan in vivo modeller for at studere tumor-stroma interaktion og deres indvirkning på terapeutisk respons bedre afspejler klinisk relevante mekanismer 7. De primære midler til at studere reaktionerne på anti-cancer terapi in vivo har været igennem målinger af tumorstørrelse og histologisk vurdering af væv fra behandlede dyr eller patienter. Imidlertid har fremskridt inden for mikroskopi og fluorescerende reportere i løbet af de seneste to årtier muliggjort visualisering af inter-og intracellulære processerved høj opløsning med levende, bedøvede dyr (intravital billeddannelse) 8. Disse intravital mikroskopi teknologier har vist sig at være særligt værdifulde til rumligt og tidsligt dissekere in vivo dynamik tumor-stroma vekselvirkninger på cellulære og subcellulære opløsning 8,9. Processer, der er blevet bragt i orden ved intravital billeddannelse indbefatter anti-tumor T-celle cytotoksicitet 10,11, interaktioner mellem T-celler og myeloide celler 12, dynamikken af ændringer i collagenpræparatet og organisation efter terapeutisk behandling 13, makrofag-afhængig cancer cell intravasation og metastase 14 og vaskulær permeabilitet 15. Der er tre store krav til intravital billeddannelse. Disse omfatter passende forberedelse og eksponering af væv til billeddannelse, fluorescerende mærkning af væv komponenter af interesse, og en parret mikroskopi-kamera system er i stand til at erhverve billeder 16. De mest almindelige strategier, der anvendes til at tage fat på disse krav omfatter: 1) heterotopiske præparater (f.eks podning af øret eller øjet orbital), permanent imaging vinduer eller blotlagt præparater (f.eks dorsalhud klap), 2) transgene fluorescerende reportere og.. fluorescerende injectables at mærke vævskomponenter og 3) multiphoton eller konfokal mikroskopi-systemer parret med fotomultiplikatorrør eller charge-coupled device (CCD) kameraer, henholdsvis 9. Vi anvender en kirurgisk forberedt hudlap model for at blotlægge inguinal brystkirtel til billeddannelse hos bedøvede dyr, som udtrykker transgener der koder for fluorescerende reportere. Billeder opnås i løbet af en periode på 12 til 40 timer ved hjælp af en intensiveret CCD (ICCD) kamera parret med en fire-laser spinning disk konfokal mikroskop system 17. Billeddannelse på denne måde har gjort det muligt at studere sådanne processer som in vivo medikamentfordeling, fase-afhængig chemotherapeutic reaktioner, type af kemoterapi-induceret celledød, og myeloid celle adfærd 5. Vi leverer en protokol til intravital billeddannelse af kræft celle respons på anti-cancer terapi og tumor-stroma interaktioner i musemodeller af brystkræft. Denne protokol kan bruges til at spore den adfærd og dødsfald blandt både kræftceller og stromale komponenter med en bred vifte af transgene og injicerbare fluorescensmærker i både transgene og transplantation modeller for perioder på op til 40 timer i en enkelt imaging session.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT mus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag mus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13.591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP mus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP-mus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Made in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, fluoresceinkonjugeret </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Rekonstitueres i dH2O (4 mg / ml, opbevares ved -20 ° C), fortyndes til 1 mg / ml i 1 x PBS </td></tr><tr><td> 10 kD dextran, Alexa Fluor 647-konjugeret </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Rekonstitueres i dH2O (4 mg / ml, opbevares ved -20 ° C), fortyndes til 1 mg / ml i 1 x PBS </td></tr><tr><td> Doxorubicin hydrochloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44.583 </td><td> Opløs i dH 2 O og opbevar ved 4 ° C, fortyndes i 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (Isofluran) </td><td> Butler Animal Health Supply </td><td> 029.450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> Propidiumiodid </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml, fortyndet 1:15 i 1 x PBS </td></tr><tr><td> Nitrogen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oxygen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Udstyr </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;regelmæssig bevel nål </td><td> BD </td><td> 305.196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Open source software </td></tr><tr><td> Spritserviet </td><td> BD </td><td> 326.895 </td><td> 70% isopropylalkohol svaberprøver </td></tr><tr><td> Anæstesisystemet </td><td> Molekylær billeddannelse Products, Co </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cover glas </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> Nr. 1 ½, 24x50 mm, desinficere med 70% isopropanol servietter </td></tr><tr><td> Curity gaze svampe (sterilt) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskopobjektglas </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Forrensede, hvis ikke for-renses, desinficere med 70% isopropanol servietter </td></tr><tr><td> Hærdede fine saks </td><td> Fin Science Tools </td><td> 14.090-11 </td><td> 2 par, rustfrit stål, skarpe skarpe tips, lige spids, 26 mm skær, 11 cm længde </td></tr><tr><td> Opvarmet tæppe </td><td> Gaymar Industries </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot perle sterilisator </td><td> Fin Science Tools </td><td> 18.000-45 </td><td> Tænde cirka 30 minutter før brug steriliseres værktøjer ved&gt; 200 ° C i 30 sek </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Elmer Produkter </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratory tape (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laboratory bånd (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Låg tilen Styrofoam skibsfart køler </td><td></td><td></td><td> Dette vil blive anvendt som det kirurgiske platform </td></tr><tr><td> Micro dissekere pincet </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 tænder, let kurve, 0,8 mm spids bredde, 4 &quot;længde </td></tr><tr><td> Micro dissekere pincet </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Savtakket, let bue, 0,8 mm spids bredde 4 &quot;længde </td></tr><tr><td> Microscope </td><td></td><td></td><td> Spinning-disk konfokalt, XYZ Piezo fase epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td> Objektbordet insert </td><td> Anvendt Videnskabelig Instrumentation </td><td></td><td> Brugerdefineret fabrikeret, med to cirkulære imaging-porte </td></tr><tr><td> MouseOx oximeter, software og sensorer </td><td> STARR Life Sciences </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Super Versi-Dry lab soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74.218-00 </td><td> Skæres i fjerdedele til foring kirurgisk platform </td></tr><tr><td> Nebulizer </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Bruges til at fugte gasser forhindrer irritation af lungevæv </td></tr><tr><td> Slip-tip engangs tuberculinsprøjte (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309.659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo winged infusionssæt </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;ultra tynd nål, 12&quot; slange </td></tr><tr><td> Betadine Spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

Den tumor mikromiljø spiller en central rolle i tumor initiering, progression, metastase, og reaktionen på cancerbehandling. Tredimensionelle co-kultursystemer anvendes ofte til at præcisere, tumor-stroma interaktioner, herunder deres rolle i lægemiddel-respons. Imidlertid kan mange af de interaktioner, der forekommer in vivo i intakt mikromiljø ikke fuldstændig kopieret i disse in vitro-indstillinger. Således har direkte visualisering af disse processer i real-tid blevet et vigtigt redskab i forståelsen tumor responser til behandlinger og identificere samspillet mellem kræftceller og stroma, der kan påvirke disse reaktioner. Her vi en fremgangsmåde til anvendelse af roterende skive konfokal mikroskopi af levende, bedøvede mus til direkte se narkotikadistributionskanalerne, cancer celleresponser og ændringer i tumor-stroma interaktioner efter administration af systemisk terapi i brystkræft-modeller. Vi beskriver procedurerne for labeling forskellige tumor-komponenter, behandling af dyr til observation terapeutiske reaktioner, og det kirurgiske indgreb for at udsætte tumorvæv til billeddannelse op til 40 timer. Resultaterne fra denne protokol, er time-lapse film, hvor sådanne processer som lægemiddel infiltration, kræft celledød og stromal cellemigration kan vurderes ved hjælp af billedanalyse software.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Vi beskriver en fremgangsmåde til afbildning reaktion på anti-cancerbehandling<em&gt; In vivo</em&gt; Og enkeltcelle-opløsning.

Levende Imaging af Drug respons i den tumormikromiljøet i musemodeller af Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Mame Modeller for 4D live-cell imaging af tumor: mikromiljø interaktioner, Impact malignt Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multi-modal Imaging af angiogenese i en nøgen rotte model af Breast Cancer knoglemetastaser Brug Magnetic Resonance Imaging, Volumetrisk Computed Tomography og Ultralyd

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse Imaging af primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra gensplejsede musemodeller for brystkræft

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

MR og PET i musemodeller af myokardieinfarkt

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Indledning af metastatisk brystkræft karcinom ved Målretning af Duktalt epitel med Adenovirus-Cre: A Novel transgene mus Model for brystkræft

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...