Name: live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Wij danken J. Cappellani en J. Qiu voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de middelen van het National Cancer Institute (U01 CA141451), het Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen voor de Cure, Long Island 2 Dag Loop naar borstkanker, Manhasset Women&#39;s Coalition Against Breast Cancer met mij vechten, en een pre-doctorale beurs van de Congressionally Breast Cancer Research Program, VS ESNESN is ook de ontvanger van de Leslie C. Snel en William Randolph Hearst Stichting Fellowships van de Watson School of Biological Sciences. HAA werd ondersteund door middelen van de Noorse Raad voor Onderzoek (160698/V40 en 151882), en Zuidoost-Regional Health Authorities (2007060).

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development.">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li><li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche.">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li><li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor.">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li><li>Breart, B., Lema&#238;tre, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8++T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice.">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li><li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li><li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows.">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL/6J.">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).</li><li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta.">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells.">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met IACUC goedgekeurde protocollen.

De reacties van tumoren voor systemische therapieën in vivo kan sterk verschillen van die van kankercellen in vitro, aangezien de micro zowel de acute respons en recidief 5 beïnvloedt. Een van de grootste obstakels voor expliceren in vivo chemoresistentie paden is de complexiteit van de interacties tussen kankercellen en hun micro-omgeving. Met name omdat solide tumoren hebben een evenwicht tussen kankercellen en stromale cellen, verstoringen van een component, zoals celdood die optreedt tijdens antikankerbehandeling kan leiden tot dramatische gevolgen voor weefsel organisatie. De intravitale beeldvormingstechniek die hier maakt de directe visualisatie van kankercel-stroma interacties in de tumoren van levende, verdoofde muizen tijdens de behandeling met anti-kanker geneesmiddelen. We maken gebruik van draaiende schijf confocale microscopie, die een relatief beperkte indringdiepte heeft (zie 17 </sup&gt;), maar onze chirurgische en labeling techniek kan worden gebruikt met andere vormen van microscopie. Films verkregen uit deze experimenten kan worden gebruikt om processen die veranderingen in fluorescentie-intensiteit (bijvoorbeeld door infiltratie van een gemerkte populatie of inductie van celdood), celmotiliteit, verdeling van injectables (bijv. vasculaire lekkage sporen), en co-sporen omvatten lokalisatie van fluorescentiesignalen 5,12,17,20. We routinematig beeld muizen voor meer dan 6 uur en ook uitgevoerd beeldvorming voor meer dan 18 uur. Dit vereist het handhaven van de muizen onder narcose continu voor deze lange tijdsperioden. Met de juiste verdoving, meer dan 90% van onze dieren te overleven 6 uur, en ongeveer 80% overleeft meer dan 18 uur. Details over hoe de lange termijn anesthesie uit te voeren zijn eerder 19 gepubliceerd. In onze ervaring, vijf factoren zijn van cruciaal belang: het vermijden van hypothermie, het vermijden van uitdroging, het onderhouden van fysiologische bloed zuurstof saturatie niveaus, uzingen bevochtigd draaggas voor isofluraan, en het houden van de dieren op het laagste niveau van de anesthesie, waarbij zij geen tekenen van pijn. Om lichaamstemperatuur houden we muizen in een verwarmde deken (bij 38 ° C). Om uitdroging te voorkomen, we injecteren van kleine hoeveelheden zout ip gedurende de gehele beeldvorming procedure. Om fysiologische bloed zuurstof saturatie op peil te houden, beginnen we met 21% zuurstof in het dragergas (in plaats van de gebruikelijke 100%). Dit stelt ons in staat om ingeademde zuurstof te verhogen als een muis - uren in een experiment - laat een daling zien in het bloed zuurstof verzadiging. In onze ervaring, het verhogen van de ingeademde zuurstof niveaus op een zodanig tijdstip (bijv. 30-40%) bijna altijd zullen stabiliseren het dier waardoor uur extra beeldvorming. Het optimale niveau van anesthesie is bereikt met de meeste muizen 1-1,5% isofluraan en resulteert in adem percentages 60-65/min en hartslag van 400-450/min. In onze beeldvorming experimenten hebben we voornamelijk gebruik van transgene muismodels (MMTV-PyMT en C3 [1]-Tag) waarin tumoren multifocale, waardoor beeldvorming van meerdere laesies in verschillende stadia van tumorprogressie in parallel op verschillende x, y posities tijdens een opnamesessie. Dit vermindert bezorgdheid over mouse naar muis variatie met betrekking tot experimenten gericht op het identificeren fase-afhankelijke therapeutische respons en vermindert het aantal dieren vereist voor imaging. De MMTV-PyMT model (en andere spontane kanker modellen) gaan door middel van progressieve histopathologische fasen die kunnen worden herkend tijdens intravitale beeldvorming, hoewel de pathologische stadiëring van de tumor laesies die kunnen worden gedaan tijdens intravitale beeldvorming is anders, en minder gedetailleerd dan die van de histologische coupes 5,17. In tegenstelling, transplantatie modellen hebben de neiging om het beste weerspiegelen laat stadium tumoren, omdat de kankercellen meestal geïsoleerd van gevorderde tumoren. Dergelijke modellen zijn dus beter geschikt voor het bestuderen van tumor-stromainteracties van laat stadium tumoren dan verschillen in deze interacties tussen verschillende stadia. We tonen voorbeelden van hoe je beeld nucleaire structurele veranderingen die zich voordoen na celdood geïnduceerd door therapie. Bij afwezigheid van anti-kankerbehandeling Deze strategie labeling plaats kan worden gebruikt om beelden celdeling in situ belichten, bijvoorbeeld hoe celproliferatie en dormantie wordt beïnvloed door de micro-omgeving. In de toekomst kunnen fluorescente labeling van mitochondriale componenten maken het mogelijk om beeld mitochondriale veranderingen tijdens apoptose. In dit protocol hebben wij ook aangetoond voorbeelden van het beeld kankercel-immune cel interacties na de therapie, maar andere microenvironmental componenten kunnen worden gevisualiseerd en afgebeeld. Bestaande transgene reporter lijnen voor stromale componenten omvatten die voor fibroblasten (bijv.., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) of cellen van de vasculatuur (bijvoorbeeld Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravitale beeldvorming maakt het mogelijk om real-time visualisatie van de interacties en processen die zich voordoen in vivo volgende toediening van chemotherapie. Met de technologie die momenteel beschikbaar is, hebben we grote vooruitgang geboekt in het begrijpen hoe myeloïde cellen beïnvloeden therapeutische respons, maar omdat de tumor micro-omgeving is zo complex, grote vooruitgang is nog steeds noodzakelijk om te beginnen te mechanistisch verdiepen in de processen die ten grondslag liggen aan milieu-gemedieerde resistentie tegen geneesmiddelen. Een van de belangrijkste verbeteringen nog steeds nodig is de identificatie van betere markers voor specifieke celpopulaties. Het belang van een betere markers goed geïllustreerd met twee van de belangrijkste componenten stromale cellen van de borst tumor micro-omgeving fibroblasten en immuuncellen. α-gladdespieractine (αSMA) wordt vaak gebruikt om te identificerenfibroblasten, maar het eiwit wordt ook uitgedrukt door vasculaire gladde spiercellen en myo cellen 24. Dus, hoewel αSMA-GFP reporter muizen bestaan, het bepalen van de specifieke celtype dat volgende tijdens een intravitale imaging experiment is een uitdaging. Evenzo zal een fluorescerende marker zoals EGFP expressie gebracht onder de c-fms promoter geven vaak meerdere subpopulaties van immuuncellen 12,17. Ofschoon zou het liefst een marker om een ​​specifiek celtype identificeren de complexiteit van de onderliggende biologie een belangrijke uitdaging in deze aanpak. Een gedeeltelijke oplossing voor dit probleem is injecteerbare labels gebruiken om verder te differentiëren subpopulaties van cellen die dezelfde fluorescerende reporter. Bijvoorbeeld worden fluorescerende dextranen opgenomen door macrofagen en kan worden gebruikt om de macrofaag subpopulaties die gelabeld door de c-fms-EGFP en Fsp1-EGFP transgene muizen reporter label <sup&gt; 17. Antilichamen geconjugeerd met fluorescerende probes zijn ook gebruikt om specifieke deelpopulaties (bijvoorbeeld de Gr1-positieve populatie van myeloïde cellen gelabeld door de c-fms-EGFP reporter 17) te identificeren. Anders tumor respons curven gegenereerd door caliper meting, die weinig mechanistische informatie over hoe of waarom tumoren reageren op de toegediende therapeutische of histologische reeksen uit weefsels geoogst op verschillende tijdstippen dat grote cohorten van dieren criteria beantwoorden, onze techniek levert rechtstreekse, kwantificeerbare informatie op de dynamiek van celdood en interacties van stromale cellen met kankercellen in kleine cohorten. Dus het voordeel dat de procedure die hier is dat het dynamische geneesmiddeleninfo reacties voorziet in de context van een intacte tumor micro-omgeving in real-time. Dergelijke informatie kan leiden tot belangrijke inzichten in de onderliggende processen die therapeutische respons te rijden 5 &lt;/ Sup&gt;.

Vaste tumoren bestaan ​​uit twee grote compartimenten: kankercellen en de stromale bestanddelen (zowel cellulaire en niet-cellulaire) die het behoud van een geschikte omgeving voor tumorgroei 1. Deze stromale bestanddelen spelen kritieke rollen in de ontwikkeling, progressie en metastase van vele soorten kanker, inclusief die van de borst 2-5. De stromale omgeving beïnvloedt ook de therapeutische respons 2,4,5. Aldus bepalen hoe kankercellen conventionele en nieuwe therapieën reageert binnen de context van het intacte micro is belangrijk voor de bevordering van ons begrip van kankerbiologie en verbeteren van de huidige therapeutische strategieën. Bovendien bepalen hoe kankercel-stroma interacties te veranderen na de toediening van de therapie is van cruciaal belang voor het begrijpen van de biologie van de tumor recidief. Organotypische co-kweken systemen zijn nuttig voor het bestuderen van tumor-stroma interacties <sup&gt; 6, maar het is duidelijk dat de methoden beschikbaar niet met succes herhalen de intacte tumor micro-omgeving in vitro, met name met betrekking tot vasculaire functie en rekrutering van immuuncellen. Inderdaad, kanker cel responsen op therapieën die in vitro waren ook sterk verschillen van die waargenomen in vivo, waarbij de micro intact 5. Zo kan in vivo modellen voor de studie van tumor-stroma interacties en hun impact op de therapeutische respons beter aansluiten bij klinisch relevante mechanismen 7. De primaire middel voor het bestuderen reacties op anti-kankertherapie in vivo zijn door metingen van tumorgrootte en histologisch onderzoek van weefsels afkomstig van dieren of patiënten. Er zijn echter ontwikkelingen in de microscopie en fluorescentie verslaggevers in de afgelopen twee decennia kon de visualisatie van inter-en intracellulaire processenmet een hoge resolutie in levende, verdoofde dieren (intravitale imaging) 8. Deze intravitale microscopie technologieën hebben bewezen bijzonder waardevol voor ruimte en tijd ontleden van de in vivo dynamiek van tumor-stroma interacties op cellulaire en sub-cellulaire resolutie 8,9. Processen die zijn ontrafeld door intravitale imaging omvatten anti-tumor T-cel cytotoxiciteit 10,11, interacties tussen T-cellen en myeloïde cellen 12, de dynamiek van veranderingen in collageen samenstelling en die na een therapeutische behandeling 13, macrofaag-afhankelijke kankercellen intravasatie en metastase 14 en vasculaire permeabiliteit 15. Er zijn drie belangrijke eisen voor intravitale beeldvorming. Deze omvatten passende voorbereiding en de blootstelling van weefsels voor de beeldvorming, TL-etikettering van het weefsel componenten van belang, en een gepaarde microscopie-camera&#39;system bouwen die beelden 16. De meest voorkomende strategieën gebruikt om deze eisen aan te pakken zijn onder meer: ​​1) heterotope preparaten (bijvoorbeeld inoculatie van het oor of oog orbitaal), permanente beeldvorming vensters of geëxterioriseerde preparaten (bijvoorbeeld, dorsale huid flap), 2) transgene fluorescerende verslaggevers en.. fluorescerende injectables om weefsel-componenten worden, en 3) multifoton of confocale microscopie systemen gecombineerd met fotomultiplicatorbuizen of charge-coupled device (CCD) camera&#39;s, respectievelijk 9. We maken gebruik van een chirurgisch voorbereide huid flap model om de lies borstklier bloot voor beeldvorming bij verdoofde dieren die transgenen die coderen voor fluorescerende verslaggevers uit te drukken. Beelden worden verkregen over een periode van 12 tot 40 uur met een geïntensiveerde CCD (ICCD) camera gekoppeld met vier draaiende schijf laser confocale microscoop systeem 17. Imaging op deze manier heeft ons toegestaan ​​om dergelijke processen te bestuderen in vivo distributie van medicijnen, podium-afhankelijke chemotherapeutic reacties, type chemotherapie geïnduceerde celdood en myeloïde celgedrag 5. Wij een protocol voor de intravitale beeldvorming van kanker cel responsen op anti-kankertherapie en tumor-stroma interacties in muismodellen van borstkanker. Dit protocol kan worden gebruikt om het gedrag en de dood van zowel kankercellen en stromale componenten met een grote verscheidenheid van transgene en injecteerbare fluorescente labels in zowel transgene en transplantatiemodellen voor een periode van maximaal 40 uur in een opnamesessie volgen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> MMTV-muizen PyMT </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1) Tag-muizen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP muizen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP muizen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Made in huis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, fluoresceïne-geconjugeerde </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Reconstitueren in dH 2 O (4 mg / ml, bij -20 ° C), verdund tot 1 mg / ml in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Dextran 10 kD, Alexa Fluor 647-geconjugeerde </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Reconstitueren in dH 2 O (4 mg / ml, bij -20 ° C), verdund tot 1 mg / ml in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Doxorubicine hydrochloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Reconstitueren in dH 2 O en bewaar bij 4 ° C, verdund in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (Isofluraan) </td><td> Butler Animal Health Supply </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> Propidiumjodide </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml, verdund 1:15 in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Stikstof </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zuurstof </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;gewone schuine naald </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Open-source software </td></tr><tr><td> Alcoholdoekje </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% isopropyl alcohol gedrenkte doekjes </td></tr><tr><td> Anesthesie-systeem </td><td> Molecular Imaging Products, Co </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cover glas </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> No 1 ½, 24x50 mm; desinfecteren met 70% isopropanol doekjes </td></tr><tr><td> Curity gaas sponzen (steriel) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Glazen objectglaasjes </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Vooraf gereinigd, zo niet vooraf gereinigd, ontsmet met 70% isopropanol doekjes </td></tr><tr><td> Geharde fijne schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.090-11 </td><td> 2 paar, roestvrij staal, scherp-scherpe punten, rechte punt, 26 mm snijkant, 11 cm lengte </td></tr><tr><td> Verwarmde deken </td><td> Gaymar Industries </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot kraal sterilisator </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18.000-45 </td><td> Schakel ongeveer 30 min vóór gebruik gereedschap bij&gt; 200 ° C gesteriliseerd gedurende 30 sec </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitvlak </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Lijm </td><td> Elmer&#39;s Producten </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorium tape (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laboratory tape (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dekseleen piepschuim verzendkosten koeler </td><td></td><td></td><td> Dit wordt gebruikt als chirurgische platform </td></tr><tr><td> Micro ontleden tang </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 tanden, lichte curve, 0,8 mm tip breedte, 4 &quot;lengte </td></tr><tr><td> Micro ontleden tang </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Getande, lichte curve, 0,8 mm tip breedte; 4 &quot;lengte </td></tr><tr><td> Microscoop </td><td></td><td></td><td> Spinning-schijf confocale, XYZ Piezo stadium epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td> Microscoop podium insert </td><td> Toegepast Wetenschappelijk Instrumentatie </td><td></td><td> Op maat vervaardigde, met twee ronde imaging-poorten </td></tr><tr><td> MouseOx oximeter, software en sensoren </td><td> STARR Life Sciences </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Super Versi-Dry lab soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74.218-00 </td><td> Snijd in kwarten voor het bekleden van chirurgische platform </td></tr><tr><td> Verstuiver </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Wordt gebruikt om gassen bevochtigen, voorkomt irritatie van longweefsel </td></tr><tr><td> Slip-tip wegwerp tuberculine spuit (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo gevleugelde infusieset </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;ultra dunne naald, 12&quot; buis </td></tr><tr><td> Betadine Spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

De tumor micro speelt een centrale rol in tumorinitiatie, progressie, metastase, en respons op anti-kankertherapieën. Driedimensionaal co-cultuur systemen worden vaak gebruikt om tumor-stroma interacties, inclusief hun rol in drug reacties zjin. Echter, veel van de interacties die optreden in vivo in het intacte micro niet volledig worden gerepliceerd in deze in vitro instellingen. Zo heeft directe visualisatie van deze processen in real-time een belangrijk hulpmiddel bij het begrijpen tumor respons op therapie en identificatie van de interactie tussen kankercellen en het stroma dat deze reacties kunnen beïnvloeden. Hier geven we een methode om met draaiende schijf confocale microscopie van levende, verdoofde muizen direct observeren distributie van medicijnen, kanker cel responsen en veranderingen in tumor-stroma interacties na toediening van systemische therapie bij borstkanker modellen. We beschrijven procedures voor Labellng verschillende tumor componenten behandeling van dieren voor het waarnemen therapeutische respons en de chirurgische procedure voor het belichten tumorweefsels voor imaging tot 40 uur. De resultaten van dit protocol zijn time-lapse filmpjes, waarin dergelijke processen als medicijn infiltratie, het afsterven van kankercellen en stromale cel migratie kan worden geëvalueerd met behulp van beeldanalyse-software.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op anti-kankerbehandeling<em&gt; In vivo</em&gt; En cel resolutie.

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Methode voor het nieuwe anti-kanker medicijn ontwikkeling met behulp van Tumor Explantaten van Chirurgische Specimens


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo bioluminescentie van Tumor Hypoxie Dynamiek van Borstkanker hersenmetastasen in een muismodel

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

MAME Modellen voor 4D live-cell imaging van de tumor: micro-omgeving interacties die van invloed zijn Maligne Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multi-modale beeldvorming van angiogenese in een Naakt ratmodel van borstkanker botmetastase Met behulp van Magnetic Resonance Imaging, Volumetrische computertomografie en Echografie

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

MRI en PET in muismodellen van myocardinfarct

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Initiatie van gemetastaseerd borstcarcinoom door Targeting van de Ductaal Epitheel met adenovirus-Cre: A Novel transgeen muismodel van de Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...