Name: live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Nous remercions J. et J. Cappellani Qiu pour le support technique. Ce travail a été soutenu par des fonds de l&#39;Institut national du cancer (U01 CA141451), le cancer du Consortium Starr, Susan G. Komen for the Cure, Long Marche Île Jour 2 de lutte contre le cancer du sein, de la Coalition des femmes contre la Manhasset cancer du sein ME, et un pré-doctoral du Programme de recherche sur le cancer du sein dirigé par le Congrès, États-Unis à ESNESN est également le destinataire de la rapide et Leslie C. William Randolph Hearst Bourses de la Fondation de l&#39;École des sciences biologiques Watson. AHA a été soutenue par des fonds du Conseil norvégien de la recherche (160698/V40 et 151 882), et du Sud-Est Regional Health Authorities (2007060).

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development.">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li><li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche.">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li><li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor.">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li><li>Breart, B., Lema&#238;tre, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8++T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice.">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li><li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li><li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows.">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL/6J.">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).</li><li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta.">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells.">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à déclarer. Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux protocoles approuvés IACUC.

Les réponses des tumeurs aux traitements systémiques in vivo peut être considérablement différents de ceux des cellules cancéreuses in vitro, comme le micro-environnement influence à la fois la réponse aiguë et la rechute 5. Un des plus grands obstacles à l&#39;expliciter dans les voies de chimiorésistance in vivo est la complexité des interactions entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement. En particulier, parce que les tumeurs solides ont établi un équilibre entre le cancer et les cellules stromales, des perturbations de l&#39;une des composantes, telles que la mort cellulaire qui se produit pendant le traitement anti-cancéreux, peut entraîner des effets dramatiques sur l&#39;organisation des tissus. La technique d&#39;imagerie intravitale fournie ici permet la visualisation directe des cellules cancéreuses-stroma interactions au sein des tumeurs de souris anesthésiées en direct, pendant le traitement avec des médicaments anticancéreux. Nous utilisons la microscopie confocale disque rotatif, qui a une profondeur de pénétration relativement limitée (voir 17 </sup&gt;), mais nos techniques chirurgicales et l&#39;étiquetage peut être utilisé avec d&#39;autres types de microscopie. Films acquises à partir de ces expériences peuvent être utilisés pour suivre les processus qui tient compte des fluctuations de l&#39;intensité de fluorescence (par exemple due à l&#39;infiltration d&#39;une population marquée ou l&#39;induction de la mort cellulaire), la motilité cellulaire, la distribution de produits injectables (par exemple pour suivre les fuites vasculaires), et co- localisation des signaux fluorescents 5,12,17,20. Nous souris d&#39;image systématiquement depuis plus de 6 heures et d&#39;imagerie également effectué pendant plus de 18 heures. Cela nécessite de maintenir en permanence les souris sous anesthésie pour ces longues périodes de temps. Avec une anesthésie adéquate, plus de 90% de nos animaux survivent à 6 heures, et environ 80% survivent plus de 18 heures. Détails sur la façon d&#39;effectuer une anesthésie à long terme ont déjà été publiés 19. Dans notre expérience, cinq facteurs sont essentiels: éviter l&#39;hypothermie, évitant la déshydratation, le maintien des taux sanguins physiologiques de saturation en oxygène, uchanter gaz porteur humidifié pour l&#39;isoflurane, et en gardant les animaux au plus bas niveau de l&#39;anesthésie au cours de laquelle ils ne montrent pas de signes de douleur. Pour maintenir la température du corps, nous gardons souris sous une couverture chauffante (à 38 ° C). Pour éviter la déshydratation, on injecte de petites quantités de solution saline ip tout au long de la procédure d&#39;imagerie. Afin de maintenir les taux sanguins physiologiques de saturation en oxygène, nous commençons avec 21% d&#39;oxygène dans le gaz porteur (plutôt que le couramment utilisé à 100%). Cela nous permet d&#39;augmenter les niveaux d&#39;oxygène en inhalation si une souris - heures dans une expérience - montre une diminution de la saturation en oxygène du sang. D&#39;après notre expérience, ce qui augmente les niveaux d&#39;oxygène inhalé au moment (par exemple 30-40%) presque toujours se stabilisera l&#39;animal permettant des heures d&#39;imagerie complémentaire. Le niveau optimal de l&#39;anesthésie est pour la plupart des souris obtenus avec 1-1,5% isoflurane et les résultats des taux de respiration et le pouls 60-65/min de 400-450/min. Dans nos expériences d&#39;imagerie, nous utilisons principalement le modèle de souris transgéniques (MMTV-C3 et PyMT [1]-Tag), dans laquelle les tumeurs sont multifocales, ce qui permet l&#39;imagerie des lésions multiples à différents stades de progression de la tumeur en parallèle à x, Y positions multiples au cours d&#39;une session de formation d&#39;image unique. Cela diminue préoccupations concernant la souris à la souris variation par rapport à des expériences visant à identifier dépendent du stade de réponses thérapeutiques et de réduire le nombre d&#39;animaux nécessaires pour l&#39;imagerie. Le modèle MMTV-PyMT (et d&#39;autres modèles de cancer spontané) passer par les étapes progressives histopathologiques qui peuvent être reconnus lors de l&#39;imagerie intravitale, bien que la mise en scène pathologique des lésions tumorales qui peuvent être faites lors de l&#39;imagerie intravitale est différent, et moins détaillé que celui de coupes histologiques 5,17. En revanche, les modèles de transplantation ont tendance à refléter les tumeurs à un stade avancé de mieux, que les cellules cancéreuses sont généralement isolés de tumeurs avancées. Ces modèles sont donc plus propice à l&#39;étude des tumeurs du stromainteractions des tumeurs à un stade avancé que les différences de ces interactions entre les différentes étapes. Nous montrons des exemples de la façon d&#39;images nucléaires changements structurels qui se produisent après la mort cellulaire induite par le traitement. En l&#39;absence de traitement anti-cancéreux, cette stratégie étiquetage peut être utilisé à la place de l&#39;image de la division cellulaire in situ, élucider, par exemple, comment la prolifération cellulaire et la dormance est influencé par le microenvironnement. À l&#39;avenir, le marquage fluorescent des composants mitochondriaux, il peut être possible de l&#39;image change mitochondriales qui se produisent pendant la mort cellulaire par apoptose. Dans ce protocole, nous avons également montré des exemples de la façon d&#39;images interactions cellulaires de cancer des cellules immunitaires après une thérapie, mais d&#39;autres composants du micro-environnement peuvent également être visualisés et imagée. Lignes existantes reporter transgéniques pour les composants du stroma comprennent ceux des fibroblastes (p. ex., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) ou les cellules du système vasculaire (par exemple Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravitale imagerie permet de visualiser en temps réel des interactions et des processus qui se déroulent dans l&#39;administration in vivo suivant la chimiothérapie. Avec la technologie actuellement disponible, nous avons fait de grands progrès dans la compréhension de la façon dont les cellules myéloïdes influencer la réponse thérapeutique, mais parce que le microenvironnement de la tumeur est si complexe, les progrès importants sont encore nécessaires pour commencer à creuser mécaniquement dans les processus sous-jacents à l&#39;environnement induite par la résistance aux médicaments. L&#39;un des progrès les plus importants restent nécessaires est l&#39;identification des meilleurs marqueurs de populations cellulaires spécifiques. L&#39;importance des meilleurs marqueurs est bien illustré avec deux des composantes les plus importantes de cellules stromales de la microenvironnement de la tumeur du sein, les fibroblastes et les cellules immunitaires. muscle lisse α-actine (αSMA) est fréquemment utilisé pour identifierfibroblastes, mais la protéine est également exprimée par les cellules musculaires lisses et les cellules myoépithéliales 24. Ainsi, bien que les souris journaliste αSMA-GFP existent, déterminer le type de cellule spécifique étant ci-après au cours d&#39;une expérience d&#39;imagerie intravitale est difficile. De même, un seul marqueur fluorescent tel que EGFP exprimée sous le promoteur de c-fms identifiera souvent multiples sous-populations de cellules immunitaires 12,17. Ainsi, bien que l&#39;on souhaiterait idéalement utiliser un marqueur unique pour identifier un type de cellule spécifique la complexité de la biologie sous-jacente constitue un défi majeur dans l&#39;utilisation de cette approche. Une solution partielle à ce problème est d&#39;utiliser des étiquettes injectables afin de mieux différencier les sous-populations de cellules exprimant le même journaliste fluorescent. Par exemple, les dextranes fluorescents sont prises par les macrophages et peuvent être utilisées pour marquer les sous-populations de macrophages qui sont marqués par le c-fms-EGFP et FSP1-EGFP souris transgéniques journaliste <sup&gt; 17. Anticorps conjugués à des sondes fluorescentes ont également été utilisés pour identifier les sous-populations spécifiques (par exemple, la population Gr1 positive des cellules myéloïdes marqués par le journaliste c-fms-EGFP 17). Contrairement aux courbes de réponse tumorale générés par étrier de mesure, qui ne fournissent que peu d&#39;informations sur la façon mécaniste ou pourquoi les tumeurs répondre à la thérapeutique administrée, ou d&#39;une série histologique provenant de tissus prélevés à différents moments qui nécessitent de grandes cohortes d&#39;animaux, notre technique permet une information directe et quantifiable sur la dynamique de la mort cellulaire et sur les interactions entre les cellules stromales de cellules cancéreuses dans de petites cohortes. Ainsi, l&#39;avantage d&#39;utiliser la procédure indiquée ici est qu&#39;il fournit des informations dynamiques sur les réactions aux médicaments dans le contexte d&#39;un microenvironnement de la tumeur intacte en temps réel. Ces informations peuvent conduire à des indications importantes sur les processus sous-jacents qui déterminent les réponses thérapeutiques 5 &lt;/ Sup&gt;.

Les tumeurs solides sont constituées de deux compartiments principaux: les cellules cancéreuses et les constituants du stroma (cellulaires et non cellulaires) qui aident à maintenir un environnement approprié pour la croissance tumorale 1. Ces constituants stromales jouent un rôle essentiel dans le développement, la progression et les métastases de nombreux types de cancers, y compris ceux de l&#39;2-5 du sein. Le milieu stromal influence également les réponses thérapeutiques 2,4,5. Ainsi, pour déterminer comment les cellules cancéreuses répondent pas aux thérapies conventionnelles et nouvelles dans le cadre du micro-environnement intact est important pour approfondir notre compréhension de la biologie du cancer et l&#39;amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles. En outre, la définition de la façon dont le cancer des cellules du stroma interactions changer à la suite de l&#39;administration de la thérapie est essentielle pour la compréhension de la biologie de récidive de la tumeur. Organotypiques systèmes de co-culture ont été utiles pour l&#39;étude des interactions stroma tumoral <sup&gt; 6, mais il est évident que les méthodes actuellement disponibles ne parvient pas à récapituler le microenvironnement de la tumeur intacte in vitro, en particulier en ce qui concerne la fonction vasculaire et le recrutement des cellules immunitaires. En effet, les réponses des cellules cancéreuses à des thérapies qui sont observés in vitro sont souvent très différentes de celles observées in vivo, où le micro-environnement est intact 5. Ainsi, dans des modèles in vivo pour l&#39;étude des interactions stroma tumoral et leur impact sur ​​la réponse thérapeutique peut mieux refléter les mécanismes cliniquement pertinentes 7. Les moyens primaires de l&#39;étude des réponses à la thérapie anticancéreuse in vivo ont été par des mesures de taille de la tumeur et l&#39;évaluation histologique des tissus provenant d&#39;animaux traités ou des patients. Cependant, les progrès de la microscopie et rapporteurs fluorescents au cours des deux dernières décennies ont permis la visualisation des processus inter-et intracellulaireà haute résolution dans les vivants, les animaux anesthésiés (intravitale imagerie) 8. Ces technologies de microscopie intravitale se sont avérés particulièrement précieux pour disséquer spatialement et temporellement dans la dynamique de l&#39;in vivo de tumeurs du stroma-interactions à résolution cellulaire et sub-cellulaire 8,9. Les processus qui ont été démêlé par imagerie intravitale comprennent une cytotoxicité anti-tumorale des cellules T 10,11, les interactions entre les cellules T et les cellules myéloïdes 12, la dynamique des changements dans la composition du collagène et de l&#39;organisation suite à un traitement thérapeutique 13, macrophages dépendant intravasation cellules cancéreuses et les métastases 14, 15 et la perméabilité vasculaire. Il ya trois exigences majeures pour l&#39;imagerie intravitale. Il s&#39;agit notamment de la préparation appropriée et l&#39;exposition des tissus pour l&#39;imagerie, le marquage fluorescent des composants du tissu d&#39;intérêt, et une paire de microscopie caméra système capable d&#39;acquérir des images 16. Les stratégies les plus couramment utilisées pour répondre à ces exigences comprennent: 1) les préparations hétérotopiques (par exemple, l&#39;inoculation de l&#39;orbitale oreille ou l&#39;œil), l&#39;imagerie permanente fenêtres, ou des préparations extériorisés (par exemple, lambeau de peau dorsale), 2) transgéniques fluorescents et des journalistes.. injectables fluorescentes pour étiqueter les composants tissulaires et 3) systèmes de microscopie confocale multiphotonique ou jumelé avec des tubes photomultiplicateurs ou Charge-Coupled Device (CCD), respectivement 9. Nous utilisons un modèle de peau chirurgicalement préparé rabat pour exposer la glande mammaire inguinale pour l&#39;imagerie chez les animaux anesthésiés qui expriment des transgènes codant rapporteurs fluorescents. Les images sont obtenues sur une période de 12 à 40 heures en utilisant un CCD intensifié (ICCD) couplé à une caméra quatre-système de disque laser microscope confocal filage 17. Imagerie de cette manière nous a permis d&#39;étudier des processus tels que la distribution de médicaments in vivo, le stade dépendant chemotherapeutic réponses, le type de mort cellulaire induite par la chimiothérapie, et le comportement des cellules myéloïdes 5. Nous fournissons un protocole pour l&#39;imagerie intravitale des réponses des cellules cancéreuses à la thérapie anticancéreuse et du stroma tumoral interactions dans les modèles murins de cancer du sein. Ce protocole peut être utilisé pour suivre les comportements et la mort des cellules cancéreuses deux et les composants du stroma avec une grande variété de transgéniques et injectables marqueurs fluorescents dans les deux modèles transgéniques et la transplantation pour des périodes allant jusqu&#39;à 40 heures en une seule séance d&#39;imagerie.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Fait maison </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, conjugué à la fluorescéine </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Reconstituer dans dH 2 O (4 mg / ml, conserver à -20 ° C); diluer à 1 mg / ml dans 1 x PBS </td></tr><tr><td> Dextran 10 kD, Alexa Fluor 647-conjugué </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Reconstituer dans dH 2 O (4 mg / ml, conserver à -20 ° C); diluer à 1 mg / ml dans 1 x PBS </td></tr><tr><td> Chlorhydrate de doxorubicine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Reconstituer dans dH 2 O et conserver à 4 ° C; diluer dans 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (isoflurane) </td><td> Alimentation Butler santé animale </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> L&#39;iodure de propidium </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml; dilué 1:15 dans PBS x 1 </td></tr><tr><td> Azote </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oxygène </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;aiguille conique régulière </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Les logiciels libres </td></tr><tr><td> Tampon imbibé d&#39;alcool </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% des tampons d&#39;alcool isopropylique </td></tr><tr><td> Système d&#39;anesthésie </td><td> Produits d&#39;imagerie moléculaire, Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Couverture en verre </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> No. 1 ½, 24x50 mm; désinfecter avec 70% d&#39;isopropanol lingettes </td></tr><tr><td> Éponges de gaze stérile (Curity) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Prénettoyé, sinon pré-nettoyage, désinfecter avec de l&#39;isopropanol 70% lingettes </td></tr><tr><td> Trempé ciseaux fins </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14090-11 </td><td> 2 paires; acier inoxydable, pointu pointus conseils, pointe droite, 26 mm de pointe, 11 cm de longueur </td></tr><tr><td> Couverture chauffante </td><td> Industries Gaymar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot stérilisateur à billes </td><td> Outils Fine Science </td><td> 18000-45 </td><td> Mettez environ 30 min avant utilisation; stériliser les outils à&gt; 200 ° C pendant 30 secondes </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Elmer Produits </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Bande de laboratoire (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bande de laboratoire (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Couvercle àune glacière en styromousse expédition </td><td></td><td></td><td> Il sera utilisé comme plate-forme chirurgicale </td></tr><tr><td> Micro pince à disséquer </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 dents, courbe légère, 0,8 mm de largeur pointe, 4 &quot;de longueur </td></tr><tr><td> Micro pince à disséquer </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Dentelé, légère courbe, 0,8 mm Largeur de pointe; 4 &quot;Longueur </td></tr><tr><td> Microscope </td><td></td><td></td><td> Spinning disque confocale, XYZ Piezo stade, capablility epifluourescence 17,25 </td></tr><tr><td> Insert platine du microscope </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td></td><td> Fabriqué sur mesure, avec deux ports d&#39;imagerie circulaires </td></tr><tr><td> MouseOx oxymètre, des logiciels et des capteurs </td><td> STARR Sciences de la Vie </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene savoir Versi-Dry soakers laboratoire </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Coupez-les en quarts de queue plate-forme chirurgicale </td></tr><tr><td> Nébuliseur </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Utilisé pour humidifier les gaz; prévient les irritations des tissus pulmonaires </td></tr><tr><td> Slip-embout de la seringue jetable tuberculine (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo ensemble de perfusion à ailes </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;ultra fine aiguille, 12&quot; de diamètre </td></tr><tr><td> Betadine pulvérisation </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

Le micro-environnement tumoral joue un rôle essentiel dans l&#39;initiation de la tumeur, la progression des métastases, et la réponse aux thérapies anti-cancéreuses. En trois dimensions des systèmes de co-culture sont souvent utilisés pour expliquer la tumeur du stroma interactions, y compris leur rôle dans la réponse aux médicaments. Cependant, la plupart des interactions qui se produisent in vivo dans le microenvironnement intacte ne peut pas être complètement repris dans ceux-ci dans les paramètres in vitro. Ainsi, la visualisation directe de ces processus en temps réel est devenu un outil important dans la compréhension des réponses tumorales aux traitements et à identifier les interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma qui peuvent influencer ces réponses. Ici, nous fournissons une méthode pour utiliser la microscopie confocale à disque rotatif en direct, des souris anesthésiées d&#39;observer directement distribution de médicaments, les réponses des cellules cancéreuses et les changements dans les tumeurs du stroma-interactions après l&#39;administration d&#39;une thérapie systémique dans des modèles de cancer du sein. Nous décrivons les procédures de labeling composants tumoraux différents, le traitement des animaux pour l&#39;observation de réponses thérapeutiques et la procédure chirurgicale pour exposer les tissus tumoraux pour l&#39;imagerie jusqu&#39;à 40 heures. Les résultats obtenus par ce protocole sont time-lapse films, dans lequel les processus tels que l&#39;infiltration de drogue, la mort des cellules cancéreuses et la migration des cellules stromales peuvent être évaluées en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Nous décrivons une méthode d&#39;imagerie de la réponse à un traitement anticancéreux<em&gt; In vivo</em&gt; Et à la résolution de la cellule unique.

Vivez l&#39;imagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Recherche

Médecine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Dans l&#39;imagerie de bioluminescence in vivo de la tumeur Dynamics hypoxie des métastases cérébrales du cancer du sein dans un modèle murin

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Modèles de MAME pour 4D imagerie des cellules vivantes de la tumeur: Interactions microenvironnement Progression impact malin

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multi-modale d&#39;imagerie de l&#39;angiogenèse dans un modèle de rat nu des métastases osseuses du cancer du sein par imagerie par résonance magnétique, la tomodensitométrie et volumétrique ultrasons

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

IRM et la TEP dans les modèles de souris de l&#39;infarctus du myocarde

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Initiation de carcinome du sein métastatique en ciblant de l&#39;épithélium canalaire avec adénovirus Cre: un modèle de souris transgénique roman du cancer du sein

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Profil moléculaire du microenvironnement de la tumeur invasive dans un modèle 3-dimensionnelle des cellules du cancer colorectal et<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblastes

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Haute fréquence imagerie par ultrasons de souris cervicales ganglions lymphatiques

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...