Name: live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Vi takker J. Cappellani og J. Qiu for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Cancer Institute (U01 CA141451), den Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen for Cure, Long Island 2 dagers tur for å bekjempe brystkreft, Manhasset kvinner Coalition Against Breast Cancer til ME, og en pre-doc fra Congressionally Regissert Breast Cancer Research Program, er USA til ESNESN også mottaker av Leslie C. Rask og William Randolph Hearst Foundation Fellowships fra Watson School of Biological Sciences. HAA ble støttet av midler fra Forskningsrådet Norge (160698/V40 og 151882), og Sørøst regionale helseforetakene (2.007.060).

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development.">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li><li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche.">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li><li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor.">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li><li>Breart, B., Lema&#238;tre, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8++T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice.">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li><li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li><li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows.">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL/6J.">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).</li><li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta.">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells.">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre. Alle dyreforsøk ble gjennomført i samsvar med IACUC godkjente protokoller.

Svarene svulster til systemisk behandling in vivo kan være dramatisk forskjellig fra de av kreftceller in vitro, som mikromiljøet påvirker både akutt respons og tilbakefall 5. En av de største hindringene for å explicating in vivo chemoresistance trasé er kompleksiteten i samspillet mellom kreftceller og deres mikromiljø. Særlig fordi solide svulster har utviklet en balanse mellom kreft og stromaceller, perturbasjoner av en komponent, for eksempel celledød som oppstår under anti-kreftbehandling, kan resultere i dramatiske effekter på vev organisasjon. Den intravital avbildningsteknikk gitt her tillater direkte visualisering av kreft celle-stroma interaksjoner innenfor svulster av levende, bedøvede mus under behandling med anti-kreft narkotika. Vi bruker spinne disk konfokalmikroskopi, som har en relativ begrenset inntrengningsdybde (se 17 </sup&gt;), men våre kirurgiske og merking kan benyttes med andre typer av mikroskopi. Filmer ervervet fra disse eksperimentene kan brukes til å spore prosesser som inkluderer endringer i fluorescensintensitet (f.eks grunnet infiltrasjon av en merket bestand eller induksjon av celledød), celle motilitet, distribusjon av injiserbare (f.eks for å spore vaskulær lekkasje), og co- lokalisering av fluorescerende signaler 5,12,17,20. Vi rutinemessig bilde mus for over 6 timer og også utført bildebehandling i over 18 timer. Dette krever opprettholde musene kontinuerlig under anestesi for disse lange tidsperioder. Med riktig anestesi, over 90% av våre dyr overleve 6 timer, og ca 80% overlever over 18 timer. Detaljer om hvordan å utføre langsiktig anestesi har blitt publisert tidligere 19. I vår erfaring, fem faktorer er avgjørende: unngå hypotermi, unngå dehydrering, opprettholde fysiologiske blod oksygenmetning nivåer, usynge fuktet bæregass for isofluran, og holde dyrene på det laveste nivået av anestesi der de ikke viser tegn til smerte. For å opprettholde kroppstemperaturen, holder vi mus under et oppvarmet teppe (ved 38 ° C). Å unngå dehydrering, injiserer vi små mengder saltvann ip gjennom hele imaging prosedyre. For å opprettholde fysiologiske blod oksygenmetning nivåer, starter vi med 21% oksygen i bæregass (snarere enn vanlig 100%). Dette gjør oss i stand til å øke inhalasjon oksygennivå om en mus - timer i et eksperiment - viser en nedgang i blod oksygenmetning. I vår erfaring, øker inhalerte oksygennivået på dette tidspunkt (f.eks 30-40%) nesten alltid vil stabilisere dyret slik at for timer ekstra bildebehandling. Optimalt nivå av anestesi er for de fleste mus oppnådd med 1-1,5% isofluran og resultater i pusten priser av 60-65/min og pulsen av 400-450/min. I våre bildebehandling eksperimenter, bruker vi hovedsakelig transgene mus modells (MMTV-PyMT og C3 [1]-tag) hvor svulster er multifokal, noe som åpner for avbildning av flere lesjoner på ulike stadier av tumor progresjon i parallell på flere x, y posisjoner i løpet av en enkelt avbildning økt. Dette reduserer bekymringer angående musen til mus variasjon med hensyn til forsøk for å identifisere stadium-avhengige terapeutiske responser, og reduserer antallet dyr kreves for avbildning. Den MMTV-PyMT modell (og andre spontane kreft modeller) går gjennom progressive histopatologiske stadier som kan gjenkjennes under intravital bildebehandling, selv om patologiske oppsetning av tumor lesjoner som kan gjøres i løpet av intravital bildebehandling er forskjellig fra, og mindre detaljert, enn histologiske snitt 5,17. I kontrast, transplantasjon modeller tendens til å reflektere sent stadium svulster best, som kreftcellene vanligvis er isolert fra avanserte svulster. Slike modeller er dermed mer mottagelig for å studere tumor-stromainteraksjoner av sent stadium svulster enn forskjeller i disse interaksjonene mellom ulike stadier. Vi viser eksempler på hvordan du bilde kjernefysiske strukturelle endringene som skjer etter celledød indusert av terapi. I fravær av anti-kreft-behandling, kan denne merking strategi i stedet brukes til bilde celledeling i situ, belyser for eksempel hvordan celleproliferasjon og dvalen påvirkes av mikromiljøet. I fremtiden kan fluorescerende merking av mitokondrie komponenter gjør det mulig å image mitokondrie endringer som oppstår under apoptotisk celledød. I denne protokollen, har vi også vist eksempler på hvordan du bilde kreft celle-immune celle interaksjoner etter behandlingen, men andre microenvironmental komponenter kan også visualiseres og avbildes. Eksisterende transgene reporter linjer for stromale komponentene inkluderer de for fibroblaster (f.eks., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) eller celler av vaskulaturen (f.eks Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravital bildebehandling tillater sanntids visualisering av interaksjoner og prosesser som oppstår in vivo etter kjemoterapi. Med dagens teknologi er tilgjengelig, har vi gjort store fremskritt i å forstå hvordan myeloid celler påvirker terapeutisk respons, men fordi svulsten mikromiljøet er så kompleks, er store fremskritt fortsatt behov for å begynne å dykke mekanistisk i prosessene som ligger til grunn miljø-mediert resistens. En av de viktigste fremskritt fremdeles kreves er identifisering av bedre markører for bestemte cellepopulasjoner. Betydningen av bedre markører er godt illustrert med to av de mest fremtredende stromale cellekomponenter av brystsvulst mikromiljøet, fibroblaster og immunceller. α-Glatt muskel aktin (αSMA) er ofte brukt for å identifiserefibroblaster, men proteinet er også uttrykt ved vaskulære glatte muskelceller og korgcellene 24. Derfor, selv om αSMA-GFP reporter mus finnes, bestemme den spesifikke celletype være følgende under en intravital avbildning eksperimentet er utfordrende. Tilsvarende vil en enkelt fluorescerende markør eksempel EGFP uttrykt under c-FMS promotor ofte identifisere flere subpopulasjoner av immunceller 12,17. Dermed, selv om en ville ideelt liker å bruke en enkelt markør for å identifisere en spesifikk celletype kompleksiteten i den underliggende biologi er en stor utfordring i å bruke denne tilnærmingen. Ett delvis løsning på dette problemet er å bruke injiserbare etiketter til ytterligere differensiere subpopulasjoner av celler som uttrykker det samme fluorescerende reporter. For eksempel, blir fluorescerende dextraner tatt opp av makrofager og kan brukes til å merke macrophage subpopulasjoner som er merket av c-fms-EGFP og Fsp1-EGFP transgene reporter mus <sup&gt; 17. Antistoffer konjugert til fluorescerende prober har også blitt brukt til å identifisere spesifikke subpopulasjoner (f.eks GR1-positive populasjonen av myeloide celler merket med c-fms-EGFP reporter 17). I motsetning til tumor respons kurver generert av caliper måling, som gir lite mekanistisk informasjon om hvordan eller hvorfor svulster reagerer administrert terapeutiske eller histologisk serie avledet fra vev høstet ved ulike tidspunkt som krever store årskull av dyr, gir vår teknikk direkte, kvantifiserbare informasjon på dynamikken i celledød og på interaksjoner stromale celler med kreftceller i små kohorter. Således er fordelen med å bruke fremgangsmåten rapportert her at det gir dynamisk informasjon på narkotika responser i sammenheng med en intakt tumor mikromiljøet i sanntid. Slik informasjon kan føre til viktig innsikt i de underliggende prosessene som driver terapeutiske tiltak 5 &lt;/ Sup&gt;.

Solide svulster består av to store seksjoner: kreftceller og de ​​stromale bestanddeler (både cellulær og ikke-cellulær) som bistår i å opprettholde et passende miljø for tumorvekst 1. Disse stromale bestanddeler spiller avgjørende roller i utvikling, progresjon og metastasering av mange typer kreft, inkludert de i brystet 2-5. Den stromal miljøet påvirker også terapeutiske tiltak 2,4,5. Således, bestemme hvordan kreftcellene reagerer til konvensjonelle og nye terapier innenfor rammen av det intakte mikromiljøet er viktig for å fremme forståelsen av kreft biologi og forbedre dagens terapeutiske strategier. Videre definerer hvordan kreft celle-stroma interaksjoner endrer etter administrasjon av behandlingen er avgjørende for å forstå biologien til tumor tilbakefall. Organotypic co-dyrking systemer har vært nyttig for å studere tumor-stroma interaksjoner <sopp&gt; 6, men det er tydelig at de metoder som er tilgjengelige kan ikke med hell rekapitulere intakt tumor mikromiljøet in vitro, særlig med hensyn til vaskulær funksjon og rekruttering av immunceller. Faktisk, cancerceller responser til behandling som er observert in vitro er ofte betydelig forskjellig fra de som ble observert in vivo, hvor mikromiljøet er intakt 5. Dermed kan in vivo modeller for å studere tumor-stroma interaksjoner og deres innvirkning på terapeutisk respons bedre reflektere klinisk relevante mekanismer 7. Den primære middel for å studere reaksjoner på anti-kreft behandling in vivo har vært gjennom målinger av størrelsen på svulsten og histologiske evaluering av vev avledet fra behandlede dyr eller pasienter. Imidlertid har fremskritt i mikroskopi og fluorescerende reportere over de siste to tiårene aktivert visualisering av inter-og intracellulær prosessermed høy oppløsning i live, bedøvede dyr (intravital imaging) 8. Disse intravital mikroskopi teknologiene har vist seg å være spesielt verdifullt for romlig og tidsmessig dissekere in vivo dynamikken i tumor-stroma interaksjoner på cellenivå og sub-mobilnettet oppløsning 8,9. Prosesser som har avslørt ved intravital bildebehandling inkluderer anti-tumor T-celle cytotoksisitet 10,11, interaksjoner mellom T-celler og myeloid celler 12, dynamikken i endringene i kollagen sammensetning og organisasjon ved terapeutisk behandling 13, makrofag-avhengig kreft celle intravasation og metastasering 14, og vaskulær permeabilitet 15. Det er tre viktige krav for intravital bildebehandling. Disse inkluderer hensiktsmessig forberedelse og eksponering av vev for bildebehandling, fluorescerende merking av vevskomponenter av interesse, og en sammenkoblet mikroskopi-kamera system stand anskaffe bilder 16. De vanligste strategier som brukes for å løse disse kravene er: 1) heterotopiske preparater (f.eks inokulering av øret eller øyet orbital), permanent bildebehandling vinduer, eller exteriorized preparater (f.eks dorsal huden klaff), 2) transgene fluorescerende reportere og.. fluorescerende injectables å merke vevskomponenter og 3) multiphoton eller konfokalmikroskopi systemer sammen med photomultiplier rør eller charge-coupled device (CCD) kameraer, henholdsvis 9. Vi bruker en kirurgisk forberedt hud klaff modell for å utsette inguinal melkekjertlene for bildebehandling i bedøvede dyr som uttrykker transgener koder fluorescerende reportere. Bildene er oppnådd over en periode på 12 til 40 timer ved hjelp av en intensivert CCD (ICCD) kamera sammen med en fire-laser spinne disk confocal mikroskop system 17. Imaging på denne måten har tillatt oss å studere slike prosesser som in vivo narkotika distribusjon, scene-avhengige lmemotherapeutic svar, type kjemoterapi-indusert celledød, og myelogen celle atferd 5. Vi tilbyr en protokoll for intravital avbildning av kreft celle responser til anti-kreft terapi og tumor-stroma interaksjoner i musemodeller av brystkreft. Denne protokollen kan brukes til å spore atferd og død både kreftceller og stromale komponenter med et bredt utvalg av transgene og injiserbare fluorescerende etiketter i både transgene og transplantasjon modeller for perioder på opp til 40 timer i en enkelt avbildning økt.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT mus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag mus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP mus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP mus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Made in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, Fluorescein-konjugert </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Rekonstitueres i dH 2 O (4 mg / ml, oppbevar ved -20 ° C); fortynnet til 1 mg / ml i 1 x PBS </td></tr><tr><td> 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-konjugert </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Rekonstitueres i dH 2 O (4 mg / ml, oppbevar ved -20 ° C); fortynnet til 1 mg / ml i 1 x PBS </td></tr><tr><td> Doksorubicinhydroklorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Rekonstituer i dH 2 O og oppbevar ved 4 ° C, fortynne i 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (isofluran) </td><td> Butler Animal Health forsyning </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> Propidium iodide </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml; fortynnet 1:15 i 1 x PBS </td></tr><tr><td> Nitrogen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oksygen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utstyr </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;vanlig skråkant nål </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Open-source programvare </td></tr><tr><td> Spritserviett </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% isopropylalkohol vattpinner </td></tr><tr><td> Anestesi system </td><td> Molecular Imaging Products, Co </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dekke glass </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> Nr. 1 ½, 24x50 mm, desinfisere med 70% isopropanol kluter </td></tr><tr><td> Trygghet gasbind svamper (sterilt) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Glass objektglass </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Pre-renset, hvis ikke pre-renset, desinfisere med 70% isopropanol kluter </td></tr><tr><td> Herdet fin saks </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 14090-11 </td><td> 2 par, rustfritt stål, skarp skarpe tips, rett spiss, 26 mm cutting edge, 11 cm lengde </td></tr><tr><td> Oppvarmet teppe </td><td> Gaymar Industries </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot perle sterilizer </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 18000-45 </td><td> Slå på ca 30 min før bruk; sterilisere verktøy ved&gt; 200 ° C i 30 sek </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Elmer Produkter </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratory tape (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laboratory tape (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lokket tilen Styrofoam skipsfart kjøligere </td><td></td><td></td><td> Dette vil bli brukt som det kirurgiske plattformen </td></tr><tr><td> Mikro dissecting tang </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 tenner, lett bue, 0,8 mm Spetsbredd, 4 &quot;lengde </td></tr><tr><td> Mikro dissecting tang </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Taggete, svak kurve, 0,8 mm Spetsbredd, 4 &quot;lengde </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td></td><td></td><td> Spinning-disk confocal, XYZ Piezo scenen, epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td> Mikroskop scenen innsats </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td></td><td> Tilpassede fabrikkert, med to sirkulære bildedannende porter </td></tr><tr><td> MouseOx oksymeter, programvare og sensorer </td><td> STARR Life Sciences </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Super Versi-Dry lab soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Skjær i fjerdedeler for fôr kirurgisk plattform </td></tr><tr><td> Forstøveren </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Brukes til å fukte gasser, forhindrer irritasjon av lunge vev </td></tr><tr><td> Slip-tip disponibel tuberkulin sprøyte (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo winged infusjonssett </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;ultra tynn nål, 12&quot; slange </td></tr><tr><td> Betadine Spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

Svulsten mikromiljøet spiller en sentral rolle i startfasen, progresjon, metastasering, og responsen på cancerbehandlinger. Tre-dimensjonale co-kultur-systemer er ofte brukt til å explicate tumor-stroma interaksjoner, inkludert deres rolle i narkotika respons. Imidlertid kan mange av interaksjoner som forekommer in vivo i intakt mikromiljøet ikke være helt replikert i disse in vitro-innstillinger. Dermed har direkte visualisering av disse prosessene i sanntid blitt et viktig verktøy for å forstå tumor respons på behandling og identifisere samspillet mellom kreftceller og stroma som kan påvirke disse svarene. Her har vi gi en fremgangsmåte for å bruke roterende disk konfokalmikroskopi av levende, bedøvde mus å direkte observere narkotika distribusjon, cancerceller responser og endringer i tumor-stroma interaksjoner etter administrasjon av systemisk terapi i brystkreft modeller. Vi beskriver prosedyrer for labeling forskjellige tumor komponenter, behandling av dyr for å observere terapeutiske reaksjoner, og den kirurgiske prosedyren for å utsette tumorvev for bildebehandling opptil 40 timer. Resultatene fra denne protokollen, er time-lapse filmer, hvor slike prosesser som narkotika infiltrasjon, kreft celledød og stromal celle migrasjon kan evalueres ved bildeanalyse programvare.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Vi beskriver en fremgangsmåte for avbildning respons på anti-kreft-behandling<em&gt; In vivo</em&gt; Og på enkelt celle oppløsning.

Lever Imaging of Drug Responses i svulsten mikromiljøet i musemodeller av Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Mame Modeller for 4D Live-celle Imaging av tumor: mikromiljøet interaksjoner som Impact Ondartet Progresjon

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multi-modal Imaging av angiogenese i en Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastase Bruke Magnetic Resonance Imaging, Volumetrisk computertomografi og ultralyd

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse Imaging av Primary Preneoplastic mammary epitelceller Avledet fra genmodifisert mus modeller av Breast Cancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

MR og PET i musemodeller av hjerteinfarkt

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Innvielse av metastatisk brystkreft ved målretting av Ductal Epitel med Adenovirus-Cre: A Novel transgene mus modell av brystkreft

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...