Name: experimental methods for testing the effects of neurotrophic peptide, adnf-9, against alcohol-induced apoptosis during pregnancy in c57bl/6 mice
Uploaded: 2013-04-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice at JoVE.com

이 연구 프로젝트는 알코올 남용과 알코올 중독에 국립 연구소에서 보너스 번호 R21AA017735 (YS)에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 알코올 남용 및 알코올 중독이나 건강의 국립 연구소에있는 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자는 또한이 원고를 편집 Charisse 몽고메리 감사드립니다.

1. 동물 사육 및 영양 펩타이드 치료 <ol><li> 2 시간 동안 남성의 홈 케이지에 암컷 생쥐 (~ 육주 세, 평균 체중 20g)을 배치하여 품종 C57BL/mice. </li><li> 즉시 나중에 정자 플러그 및 / 또는 질 세포진 검사를 확인합니다. </li><li> 긍정적 인 경우, 배아 0 일 (E0)로이 시점을 지정합니다. </li><li> 최근에 설명 된대로 E7에, 제어 및 치료 그룹에 임신 한 암컷 체중 성냥 (3 그룹)가 할당됩니다 4 : 1) 알코?...

<ol>
	<li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide,+NAP,+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li><li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+peptide,+colivelin,+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mice:+signaling+pathway+investigations.">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li><li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL/6+mice:+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li><li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis,+in+part,+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li><li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL/6+mice:+a+proteomic+investigation.">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li><li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide.">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li><li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor:+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides.">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li><li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome.">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li><li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected,+in+part,+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li><li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide.">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li><li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li><li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoactive+intestinal+peptide+(VIP)+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures:+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson's+disease.">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li><li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress.">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li></ol>

본 연구에서 제시 한 방법론과 기술은 태아 태아 두뇌에 알코올 노출과 이러한 효과의 예방에 영양 펩티드의 역할의 효과를 보여줍니다. 이들은 다른 임신 단계에서 남용 또는 태아 뇌의 다른 독성 화학 물질의 다른 약물을 연구하는 방법에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 사육 패러다임에 관해서, 어떤 경우에는 정자 플러그의 검출은 관찰되지 않을 수 있습니다. 이 시점...

여기에 설명 된 실험 방법의 목표는 먹이 microdissecting 및 세포 죽음을 감지, 번식과 관련된 여러 가지 기술을 사용하여 태아 알코올 노출 모델에서 영양 펩타이드의 신경 효과를 평가하는 것입니다. 우리 실험실에서 작업 알코올의 양 기간에 인간 마시는 패러다임과 유사 할 수있는 적당한 음주의 모델로 알코올과 혼합 액체 음식을 포함했다하면 1-5 소비. 우리와 다른 태아 알코올 노출의 해로운 영향으로부터 신경 세 가지 펩타이드 유도체를 발견했습니다. 동물 모델을 사용하여 배아 단계에서 알코올 노출을 조사 연구는 신경 보호의 잠재적 인 메커니즘의 신분으로 이어질 중재 절차의 개발을 허용 할 수 있습니다. 이 임신 중 알코올 노출의 해로운 효과의 신경 효과와 감쇠에 대한 충분한 정보를 제공 할 수 있습니다. 태아 알코올 노출의 영향을 가능한 한 방지 체외 6,7와 in vivo 1,2,4,8,9의 신경 보호에 관여하는 것으로 알려져있다 펩타이드와 임신 한 생쥐의 치료를 포함 할 수 있습니다. 이러한 펩타이드 중, ADNF-9 또는 SAL로 알려진 SALLRSIPA은, 활동에 따라 신경 영양성 인자 (ADNF) 7,10에서 파생됩니다. 순서 NAPVSIPQ 펩티드라고 NAP, 또 다른 펩티드 활동에 따라 신경 단백질 (ADNP) 6,11에서 파생 된 알코올 노출 12,13과 관련된 산화 스트레스에 대한 강력한 보호 효과를 보여 주었다. 또한, 우리는 최근 태아 알코올 노출 모델 2에 중요한 신경 역할을 표시하는 새로운 합성 펩티드, colivelin을 발견했습니다. Colivelin는 ADNF-9 AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP)으로 구성되어 있습니다. 이 펩티드의 사용의 중요성은 그들이 할 수있는 기능을 가지고있다알코올에 의한 세포 사멸과 뇌의 성장 적자의 영향을 방지하기 위해 뇌 혈액 장벽을 통과. 실험 방법은 알콜에 의한 세포 사멸에 대한 신경 보호 효과를 테스트하기 위해 C57BL / 6 생쥐를 사용 하였다. 우리는 그것이 정자 플러그 및 질 세포진 검사 1-5의 검출에 의해 밝혀 질 수 정확하게, 배아 일 0 (E0)를 추정하기 위해 대신 하룻밤 사육 2 시간 창을 채택했다. 우리는이가 임신 한 쥐에 스트레스를 유발할 수 있습니다 투여 경로를 통해 대신 알코올 배송 무료 액세스로 간주되는, 공급 튜브 액체 다이어트를 사용했습니다. 반면에, microdissection을 조기 배아 단계에서 태아의 뇌를 해부 할 때 발생할 수있는 태아 뇌 조직의 부드러움으로 인해 도전 할 수 있습니다. 여기, 우리는 microdissection을 관련된 모든 문제를 처리하는 시각 기술을 보여줍니다. 또한, 태아의 뇌 절편도 도전 할 수 있기 때문에, 우리는 채택젤라틴 포함 껍질 - 멀리하여 금형 태아 두뇌를 포함 포함하는 기술. 우리는 50 μm의 두께로 무료 부동 섹션에서 태아 뇌를 절단에 성공했다. 이것은 우리가 세포 죽음의 식별을 포함하여, 태아의 뇌 섹션에서 콘텐츠 단백질의 변화를 조사 할 수 있습니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus Slides</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48311-703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAP PEN</td>
 <td>Research Products Int. Corp.</td>
 <td>195506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-Plend Open Mailer </td>
 <td>Heathrow Scientific, LLC</td>
 <td>HS 15983G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peel away embedding molds</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70182</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In situ cell death detection kit, POD</td>
 <td>Roche Diagnostics, Inc</td>
 <td>11684817910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14170-120 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelatin Type A</td>
 <td>FisherScientific</td>
 <td>G8-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc </td>
 <td>Leica M60, KL 200 LED</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro-Vibratome</td>
 <td>Leica, Inc </td>
 <td>Leica VT 1000S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Ultra Fine Forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11370-40</td>
 <td>2 pairs</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Graduate 30 ml feeding tubes</td>
 <td>Dyets, Inc </td>
 <td>900012 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vitamin Mix </td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8031 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral Mix</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8598 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maltose Dextrin</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>3650 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons</td>
 <td>111000190-SS05 </td>
 <td>Pharmco-AAPER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc</td>
 <td>LEICA DM 4000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

experimental methods for testing the effects of neurotrophic peptide, adnf-9, against alcohol-induced apoptosis during pregnancy in c57bl/6 mice

태아의 뇌 성장의 초기 배아 단계에서 태아 알코올 노출의 영향을 조사하는 실험 디자인에 도전하고 있습니다. 이 대부분은 태아의 뇌와 알코올 태아 노출로 인한 세포 사멸 세포의 결정에 대한 자신의 절편의 microdissection을의 어려움 때문이다. 실험은 태아의 뇌 조직에있는 세포 죽음의 식별 사육 쥐에서 시각화 기술을 제공합니다 여기에 설명. 본 연구에서는 C57BL 사용 / 알코올에 의한 세포 사멸에 대한 태아 알코올 노출과 영양 펩타이드의 역할을 연구 동물 모델로 6 마우스. 사육 배아 시대의 정확한 단계를 결정하기 위해 2 시간 매트 창으로 구성되어 있습니다. 설립 태아 알코올 노출 모델은 태아의 뇌에있는 태아 알코올 노출의 효과를 결정하기 위해 본 연구에서 사용되었다. 이것은 임신 한 쥐에 대한 영양소의 유일한 소스로 알코올이나 쌍 공급 액체 다이어트에 무료로 액세스를 포함합니다. <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; 후자는 도전 할 수 있기 때문에 태아 및 태아의 두뇌 microdissection을의 해부와 관련된 기술은주의 깊게 설명되어 있습니다. microdissection을이 입체 현미경과 초 미세 집게를 필요로합니다. 태아의 뇌를 해부하기위한 단계별 절차를 시각적으로 제공됩니다. 태아의 뇌는 primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기본을 해부한다. apoptosis를 조사를 위해, 태아의 두뇌가 먼저 vibratome 기기와 함께 자신의 절편을 촉진하기 위하여 필 - 멀리 금형을 사용하여 젤라틴에 포함됩니다. 파라 포름 알데히드에 포함 된 고정 태아의 뇌는 쉽게 단면이며, 무료 부동 섹션은 세포 사멸 또는 세포 죽음의 결정에 superfrost 플러스 슬라이드에 장착 할 수 있습니다. TUNEL (TDT-중재 dUTP 닉 엔드 라벨, TDT : 전이 터미널 deoxynucleotidyl) 분석은 세포 사멸 또는 사멸 세포를 식별하는 데 사용되었습니다. 그것은 주목할만한 그 APoptosis 및 세포 매개 세포 독성은 DNA 파편을 특징으로하고 있습니다. 따라서, 시각 TUNEL 양성 세포는 세포 사멸 또는 세포 사멸 세포의 지표입니다. 여기에 실험 디자인은 태아 두뇌에 임신 중에 알코올의 영향을 연구 설립 액체 다이어트의 사용에 대한 정보와 신경성 펩티드의 역할을 제공합니다. 이 번식 임신 한 쥐를 먹이 태아의 두뇌를 microdissecting 및 세포 사멸을 결정을 포함한다. 함께, 이러한 시각 및 텍스트 기술은 태아 두뇌에 유해한 에이전트의 태아 노출 조사를위한 소스가 될 수 있습니다.

실험 방법은 2 시간 사육 창 정확한 임신 단계를 추정하는 것이 필수적입니다 것을 보여 여기에 설명. 우리는 E13의 나이에 배아의 절개를 증명하고있다. 우리는 또한 E13에 태아 뇌의 microdissection을을 보여 주었다. 절차는 그림 1에서 설명한 여러 단계 (AC), 포함한다. 태아의 뇌는 primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기초 (그림 1)을 해부한다. 태아의 뇌는 그 면역 탐?...

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Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

실험 디자인은 태아의 뇌 임신 중 세포 사멸 및 신경성 펩타이드의 응용 프로그램에서 알코올 노출의 효과를 공부에 여기에 초점을 제안했다. 사육에서 태아 뇌의 컬렉션에 대한 자세한 설명이 설명되어 있습니다. 세포 사멸의 결정을위한 기법도 자세히 설명되어 있습니다.

알코올에 의한 C57BL 임신 중 세포 자멸사 / 6 마​​우스에 대하여, 신경 친 화성 펩타이드, ADNF-9의 효과를 테스트하기위한 실험 방법

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

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Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic 소뇌 문화 : Apoptotic 도전과 감지

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Measuring Motor Coordination in Mice

마우스에 모터 조정을 측정

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

실험 경제 기능 MRI 방법을 사용하여 위험하고 모호한 옵션의 주관적 가치를 측정

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

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Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

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MOG35-55를 받게 하는 C57BL/6 쥐에 화살 평면 운동학 걸음 걸이 분석 실험적인 자기 면역 뇌 유발

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the ...

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Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

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Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

알코올에 의한 C57BL 임신 중 세포 자멸사 / 6 마​​우스에 대하여, 신경 친 화성 펩타이드, ADNF-9의 효과를 테스트하기위한 실험 방법

알코올에 의한 C57BL 임신 중 세포 자멸사 / 6 마우스에 대하여, 신경 친 화성 펩타이드, ADNF-9의 효과를 테스트하기위한 실험 방법