Name: depletion of ribosomal rna for mosquito gut metagenomic rna-seq
Uploaded: 2013-04-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le NIH subvention 1SC2GM092789-01A1, et MS était un érudit de la recherche NMSU Howard Hughes Programmes Établissement de recherches médicales de premier cycle. La vidéo a été réalisé et produit par Amy Lanasa et coordonné par le Dr Philip Lewis avec le Creative Media Institute à NMSU.

Procédure 1. Élevage Mosquito <ol><li> Arrière moustique Anopheles gambiae G3 souche dans un insectarium à 27,5 ° C avec une humidité de 80% et le cycle h 12:12 de lumière / obscurité. </li><li> Les larves se nourrissent de la nourriture pour chat au sol avec de la levure de bière avec un rapport de 1:1. </li><li> Nourrir les moustiques adultes sur le sang des souris au jour 3 post-levée pour la production d&#39;œufs. </li></ol> 2. Dissection intestin...

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+the+Bemisia+tabaci+Transcriptome+Reveals+a+Highly+Diverse+Bacterial+Community+and+a+Robust+System+for+Insecticide+Resistance.">Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance.</a> PLoS One. 7, e35181 (2012).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+metatranscriptome+of+the+protistan+community+in+Coptotermes+formosanus+with+emphasis+on+the+lignocellulolytic+system.">Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system.</a> Genomics. 99, 246-255 (2012).</li><li>Gosalbes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+approach+to+analyze+the+functional+human+gut+microbiota.">Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota.</a> PLoS One. 6, e17447 (2011).</li><li>Urich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assessment+of+soil+microbial+community+structure+and+function+through+analysis+of+the+meta-transcriptome.">Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome.</a> PLoS One. 3, e2527 (2008).</li><li>Gilbert, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+large+numbers+of+novel+sequences+in+the+metatranscriptomes+of+complex+marine+microbial+communities.">Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities.</a> PLoS One. 3, e3042 (2008).</li><li>Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+deeply+sequenced+marine+microbial+metatranscriptome.">Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome.</a> ISME J. 5, 461-472 (2011).</li><li>Poretsky, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+day/night+metatranscriptomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+North+Pacific+subtropical+gyre.">Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre.</a> Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).</li><li>Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+activity+of+paddy+soil+bacterial+communities.">Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities.</a> Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).</li><li>Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+mRNA+from+soil.">Extraction of mRNA from soil.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+two+ribosomal+RNA+removal+methods+for+microbial+metatranscriptomics.">Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics.</a> Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).</li><li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+mRNA+purification+by+magnetic+capture-hybridization+method.">Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method.</a> Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).</li><li>Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+quantitative+analyses+of+a+universal+rRNA-subtraction+protocol+for+microbial+metatranscriptomics.">Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics.</a> ISME J. 4, 896-907 (2010).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PLoS One. 6, e24767 (2011).</li><li>Su, C., Sordillo, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+enrich+mRNA+from+total+prokaryotic+RNA.">A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA.</a> Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).</li><li>Gusmao, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-dependent+and+culture-independent+characterization+of+microorganisms+associated+with+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+(L.)+and+dynamics+of+bacterial+colonization+in+the+midgut.">Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut.</a> Acta Trop. 115, 275-281 (2010).</li><li>Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+identification+of+midgut+bacteria+from+field-caught+Anopheles+gambiae+sensu+lato+and+A.+funestus+mosquitoes+reveals+new+species+related+to+known+insect+symbionts.">16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).</li><li>Simon, C., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analyses:+past+and+future+trends.">Metagenomic analyses: past and future trends.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).</li><li>Wang, Y., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+fragments+in+bacterial+16S+rRNA+genes+and+primer+design+for+16S+ribosomal+DNA+amplicons+in+metagenomic+studies.">Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies.</a> PLoS One. 4, e7401 (2009).</li><li>Hunt, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+23S+rRNA+PCR+primers+for+use+in+phylogenetic+studies+of+bacterial+diversity.">Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).</li></ol>

Une communauté microbienne complexe réside dans l&#39;écosystème intestin du moustique, 14,16,17. Metatranscriptomic séquençage (ARN-seq) peut révéler des informations de contexte dépend fonctionnelle en interrogeant la totalité du transcriptome 4,18 microbienne. Techniquement, oligo-d (T) d&#39;enrichissement de l&#39;ARNm procaryote médiation n&#39;est pas applicable en raison de l&#39;absence de stabilité poly (A) queues des messagers. Alternativement, l&#39;appauvrissement de l&#39;...

La technologie de séquençage de nouvelle génération a beaucoup progressé étude métagénomique en permettant d&#39;évaluer la composition taxonomique et génétique d&#39;une fonctionnalité associations microbiennes. Séquençage d&#39;ARN (RNA-Seq) 1 peut contourner culture à base de méthodes pour étudier metatranscriptomes microbiennes dans 2-5 contextes différents. Un obstacle majeur à microbien ARN-seq est la difficulté à enrichir l&#39;ARNm, comme les espèces d&#39;ARNm procaryotes ne sont pas stable polyadénylé. Par conséquent, oligo d (T) l&#39;enrichissement messager médiation n&#39;est pas applicable. Suppression de l&#39;ARNr abondante est une approche alternative pour enrichir l&#39;ARNm. Trousses commerciales d&#39;épuisement ARNr, comme Microexpress kit ARNm enrichissement bactérien (Ambion), RiboMinus Isolation Kit transcriptome (bactéries) (Life Technologies), et l&#39;ARNm UNIQUEMENT kit d&#39;isolation d&#39;ARNm procaryote (Epicentre) qui dégrade préférentiellement ARNr avec une exonucléase, ont été utilisés de suppression de l&#39;ARNr 6-8. Cependant, les sondes de capture dans Microexpressou RiboMinus sont bons pour enlever ARNr connu de types de bactéries Gram-positives et Gram-négatives (voir les spécifications du fabricant), mais moins compatible avec les ARNr des microbes inconnus. Par conséquent, la suppression peut être moins efficace pour les 8-10 des échantillons métagénomique. Par ailleurs, la fidélité abondance de l&#39;ARNm était discutable lorsque le traitement a été appliqué exonucléase 11. Dans l&#39;ensemble, la soustraction basée sur l&#39;appauvrissement de l&#39;ARNr est moins biaisé et plus efficace dans l&#39;enrichissement d&#39;ARNm dans les paramètres métagénomiques 10-13. L&#39;intestin du moustique, accueille une communauté microbienne dynamique 14. Nous cherchons à caractériser la fonction du microbiome intestin du moustique en utilisant l&#39;ARN-Seq. Dans un échantillon d&#39;ARN isolés à partir des entrailles de moustiques, les deux ARN moustiques et des microbes sont présents. Ici, nous décrivons un protocole modifié d&#39;utiliser des sondes ARNr communautaires spécifiques pour épuiser les ARNr efficacement les moustiques et microbienne par hybridation soustractive. L&#39;ARNm résultantéchantillons enrichis sont appropriés pour l&#39;ARN-Seq. Le flux global est représenté dans la figure 1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Meta-G-Nome 				DNA isolation kit</td>
 <td>Epicentre</td>
 <td>MGN0910</td>
 <td>Metagenomic 				DNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TriPure </td>
 <td>Roche</td>
 <td>11667165001</td>
 <td>Mdetagenomic 				RNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEGAscript 				T7 kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1334</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA probes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNaseZap</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9780</td>
 <td>RNase 				free working area </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-16-UTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11388908910</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-11-CTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4739205001</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin 				magnetic beads</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1420S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic 				separation rack</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1506S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy 				mini kit</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>74104</td>
 <td>Purification 				of subtracted RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free 				DNase Set</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>79254</td>
 <td>Removal 				DNA contamination </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 				RNA 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Gen 				PRO200 				Homogenizer</td>
 <td>PRO 				Scientific</td>
 <td>01-01200</td>
 <td>Mosquito 				gut tissue homogenization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NanoDrop 				1000 Spectrophotometer</td>
 <td>Thermo 				Scientific</td>
 <td></td>
 <td>DNA 				&amp; RNA quantitation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2100 				Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>G2940CA</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

depletion of ribosomal rna for mosquito gut metagenomic rna-seq

L&#39;intestin du moustique, accueille les communautés microbiennes dynamiques à travers les différentes étapes du cycle de vie de l&#39;insecte. Caractérisation de la capacité génétique et la fonctionnalité de la communauté intestin permettra de mieux comprendre les effets du microbiote intestinal sur les traits de vie des moustiques. Métagénomique RNA-Seq est devenu un outil important pour analyser les transcriptomes de divers microbes présents dans une communauté microbienne. L&#39;ARN messager comprend généralement que 1-3% de l&#39;ARN total, tandis que ARNr constitue environ 90%. Il est difficile pour enrichir l&#39;ARN messager à partir d&#39;un échantillon d&#39;ARN microbienne métagénomique, car la plupart des espèces d&#39;ARNm procaryotes n&#39;ont pas stables poly (A) des queues. Cela empêche oligo d (T) isolement d&#39;ARNm médiée. Ici, nous décrivons un protocole qui emploie échantillon dérivé ARNr des sondes de capture pour enlever ARNr partir d&#39;un échantillon d&#39;ARN total de métagénomique. Pour commencer, à la fois contre les moustiques et microbiennes petits et grands fragments d&#39;ARNr sous-unités sont amplifiés à partir d&#39;un échantillon d&#39;ADN métagénomique communauté. Ensuite, la communautécommunautaires spécifiques biotinylés antisens ribosomique sondes d&#39;ARN sont synthétisés in vitro en utilisant l&#39;ARN polymérase T7. Les sondes biotinylées ARNr sont hybridées à l&#39;ARN total. Les hybrides sont capturés par des billes revêtues de streptavidine et retiré de l&#39;ARN total. Ce protocole basé sur la soustraction élimine efficacement à la fois contre les moustiques et l&#39;ARNr microbienne de l&#39;échantillon d&#39;ARN total. L&#39;échantillon enrichi en ARNm est ensuite traité pour l&#39;amplification de l&#39;ARN et ARN-Seq.

Le protocole comprend trois sections: (1) la préparation de matrices d&#39;ADN métagénomique pour l&#39;ARNr PCR, (2) la création d&#39;échantillonnage des sondes spécifiques de l&#39;ARNr de capture, (3) l&#39;épuisement de l&#39;ARNr de l&#39;ARN total par hybridation soustractive. Isolation de haute qualité métagénomique ADN et l&#39;ARN est essentielle pour l&#39;ensemble du processus. Le protocole modifié Meta-G-Nome isolement de l&#39;ADN de haute qualité donne ADN métagénomique de viscères de moust...

Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq at JoVE.com

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Un protocole d&#39;ARN ribosomal épuisement (ARNr) a été développé afin d&#39;enrichir l&#39;ARN messager (ARNm) pour l&#39;ARN-seq de la metatranscriptome intestin du moustique. Les sondes de prélèvement ARNr spécifiques, qui ont été utilisés pour retirer l&#39;ARNr par soustraction, ont été créés à partir du moustique et ses microbes intestinaux. Performances du protocole peut entraîner la suppression d&#39;environ 90-99% de l&#39;ARNr.

L&#39;appauvrissement de l&#39;ARN ribosomique pour métagénomique Gut Mosquito ARN-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Grands écrans des banques métagénomiques

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Recherche

Biologie

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

Protocole pour l&#39;élevage des moustiques (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

Transcription in vitro et plafonnement de l&#39;ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Génération substrat pour des endonucléases de CRISPR / Cas Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

La nouvelle génération de séquençage de l&#39;ARN ribosomal 16S gènes amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Un protocole expérimental et de la bioinformatique pour les analyses d&#39;ARN-Seq de la photopériode diapause dans le Asian Tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiologiques Recordings et ARN séquençage des annexes gustatives du Mosquito fièvre jaune<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...