Name: depletion of ribosomal rna for mosquito gut metagenomic rna-seq
Uploaded: 2013-04-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend 1SC2GM092789-01A1, og MS var en stipendiat av NMSU Howard Hughes Medical Institution Undergraduate forskningsprogrammer. Videoen ble regissert og produsert av Amy Lanasa og koordinert av Dr. Philip Lewis med Creative Media Institute ved NMSU.

Prosedyre 1. Mygg Rearing <ol><li> Bak mygg Anopheles gambiae G3 belastning i en insectary ved 27,5 ° C med 80% luftfuktighet og 12:12 hr syklus av lys / mørke. </li><li> Mate larver med bakken kattemat med ølgjær på forholdet 1:1. </li><li> Mate voksne mygg på mus blod på dag 3 etter fremveksten for eggproduksjon. </li></ol> 2. Mygg Gut Dissection <ol><li> Autoclave Disseksjonsverktøyer (lysbilder og tang). </li><li> Samle 50 mygg ved hjelp av en vi...

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+the+Bemisia+tabaci+Transcriptome+Reveals+a+Highly+Diverse+Bacterial+Community+and+a+Robust+System+for+Insecticide+Resistance.">Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance.</a> PLoS One. 7, e35181 (2012).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+metatranscriptome+of+the+protistan+community+in+Coptotermes+formosanus+with+emphasis+on+the+lignocellulolytic+system.">Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system.</a> Genomics. 99, 246-255 (2012).</li><li>Gosalbes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+approach+to+analyze+the+functional+human+gut+microbiota.">Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota.</a> PLoS One. 6, e17447 (2011).</li><li>Urich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assessment+of+soil+microbial+community+structure+and+function+through+analysis+of+the+meta-transcriptome.">Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome.</a> PLoS One. 3, e2527 (2008).</li><li>Gilbert, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+large+numbers+of+novel+sequences+in+the+metatranscriptomes+of+complex+marine+microbial+communities.">Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities.</a> PLoS One. 3, e3042 (2008).</li><li>Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+deeply+sequenced+marine+microbial+metatranscriptome.">Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome.</a> ISME J. 5, 461-472 (2011).</li><li>Poretsky, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+day/night+metatranscriptomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+North+Pacific+subtropical+gyre.">Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre.</a> Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).</li><li>Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+activity+of+paddy+soil+bacterial+communities.">Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities.</a> Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).</li><li>Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+mRNA+from+soil.">Extraction of mRNA from soil.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+two+ribosomal+RNA+removal+methods+for+microbial+metatranscriptomics.">Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics.</a> Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).</li><li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+mRNA+purification+by+magnetic+capture-hybridization+method.">Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method.</a> Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).</li><li>Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+quantitative+analyses+of+a+universal+rRNA-subtraction+protocol+for+microbial+metatranscriptomics.">Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics.</a> ISME J. 4, 896-907 (2010).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PLoS One. 6, e24767 (2011).</li><li>Su, C., Sordillo, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+enrich+mRNA+from+total+prokaryotic+RNA.">A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA.</a> Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).</li><li>Gusmao, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-dependent+and+culture-independent+characterization+of+microorganisms+associated+with+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+(L.)+and+dynamics+of+bacterial+colonization+in+the+midgut.">Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut.</a> Acta Trop. 115, 275-281 (2010).</li><li>Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+identification+of+midgut+bacteria+from+field-caught+Anopheles+gambiae+sensu+lato+and+A.+funestus+mosquitoes+reveals+new+species+related+to+known+insect+symbionts.">16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).</li><li>Simon, C., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analyses:+past+and+future+trends.">Metagenomic analyses: past and future trends.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).</li><li>Wang, Y., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+fragments+in+bacterial+16S+rRNA+genes+and+primer+design+for+16S+ribosomal+DNA+amplicons+in+metagenomic+studies.">Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies.</a> PLoS One. 4, e7401 (2009).</li><li>Hunt, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+23S+rRNA+PCR+primers+for+use+in+phylogenetic+studies+of+bacterial+diversity.">Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).</li></ol>

En kompleks mikrobiell samfunnet ligger i myggen gut økosystemet 14,16,17. Metatranscriptomic sekvensering (RNA-seq) kan avsløre kontekstavhengig funksjonell informasjon ved avhør hele mikrobielle transkriptom 4,18. Teknisk sett er oligo-d (T)-mediert anrikning av prokaryot mRNA ikke anvendelig på grunn av fravær av stabile poly (A) haler av budbringere. Alternativt har rRNA uttømming blitt brukt for mRNA berikelse. Her har vi utviklet et subtraksjon-basert protokoll for å utarme rRNA hjelp ...

Neste generasjons sekvensering teknologi har sterkt avanserte metagenomikk studie ved at å vurdere taksonomisk sammensetning og genetisk funksjonaliteten til en mikrobiell samling. RNA-sekvensering (RNA-Seq) 1 kan omgå kultur-baserte metoder for å undersøke mikrobielle metatranscriptomes i ulike sammenhenger 2-5. En hovedhindring for mikrobiell RNA-seq er vanskeligheten i berikende mRNA, som prokaryote mRNA arter ikke blir stabilt polyadenylated. Derfor er oligo d (T)-mediert messenger berikelse ikke aktuelt. Fjerning av rikelig rRNA er en alternativ tilnærming til å berike mRNA. Kommersielle rRNA uttømming kits, eksempel Microexpress Bakteriell mRNA Enrichment kit (Ambion), RiboMinus transkriptom Isolation Kit (Bakterier) (Life Technologies), og mRNA-ONLY prokaryot mRNA Isolation Kit (Epicentre) som fortrinnsvis forringer rRNA med en eksonuklease, har blitt brukt for fjerning rRNA 6-8. Men den fange sonder i Microexpresseller RiboMinus er bra for å fjerne kjente rRNA fra typiske Gram-positive og Gram-negative bakterier (se produsentens spesifikasjoner), men mindre kompatibel med rRNA fra ukjente mikrober. Følgelig kan fjerning være mindre effektiv for metagenomic prøver 8-10. Dessuten var mRNA overflod fidelity tvilsom når eksonuklease behandlingen ble utført 11. Totalt var subtraksjon-baserte rRNA uttømming mindre partisk og mer effektive i mRNA berikelse i metagenomic innstillinger 10-13. Mygg gut plass en dynamisk mikrobiell fellesskap 14. Vi er interessert i å karakterisere funksjon mygg gut microbiome Ved å bruke RNA-Seq. I en RNA prøve isolert fra mygg guts, både mygg og mikrobielle RNA er tilstede. Her beskriver vi en modifisert protokoll for å bruke samfunnet spesifikke rRNA sonder for å effektivt utarme mygg og mikrobiell rRNA av subtraktiv hybridisering. Den resulterende mRNAberiket prøver som er aktuelle for RNA-Seq. Den generelle arbeidsflyten er avbildet i figur 1..

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Meta-G-Nome 				DNA isolation kit</td>
 <td>Epicentre</td>
 <td>MGN0910</td>
 <td>Metagenomic 				DNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TriPure </td>
 <td>Roche</td>
 <td>11667165001</td>
 <td>Mdetagenomic 				RNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEGAscript 				T7 kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1334</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA probes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNaseZap</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9780</td>
 <td>RNase 				free working area </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-16-UTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11388908910</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-11-CTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4739205001</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin 				magnetic beads</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1420S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic 				separation rack</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1506S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy 				mini kit</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>74104</td>
 <td>Purification 				of subtracted RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free 				DNase Set</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>79254</td>
 <td>Removal 				DNA contamination </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 				RNA 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Gen 				PRO200 				Homogenizer</td>
 <td>PRO 				Scientific</td>
 <td>01-01200</td>
 <td>Mosquito 				gut tissue homogenization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NanoDrop 				1000 Spectrophotometer</td>
 <td>Thermo 				Scientific</td>
 <td></td>
 <td>DNA 				&amp; RNA quantitation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2100 				Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>G2940CA</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

depletion of ribosomal rna for mosquito gut metagenomic rna-seq

Mygg gut plass dynamiske mikrobielle samfunn på tvers av ulike stadier av insekter livssyklus. Karakterisering av genetisk kapasitet og funksjonalitet av tarmen samfunnet vil gi innsikt i virkningene av gut bakterieflora på mygg liv trekk. Metagenomic RNA-Seq har blitt et viktig verktøy for å analysere transcriptomes fra ulike mikrober til stede i en mikrobiell samfunnet. Messenger RNA omfatter vanligvis bare 1-3% av total RNA, mens rRNA utgjør ca 90%. Det er utfordrende å berike messenger RNA fra en metagenomic mikrobiell RNA prøve fordi de fleste prokaryote mRNA arter mangler stabile poly (A) haler. Dette forhindrer oligo d (T)-mediert mRNA isolasjon. Her beskriver vi en protokoll som sysselsetter prøven stammer rRNA fange sonder for å fjerne rRNA fra en metagenomic total RNA prøve. Til å begynne, er både mygg og mikrobielle små og store subenheten rRNA fragmenter forsterket fra en metagenomic samfunnet DNA-prøve. Deretter kommunikanity spesifikke biotinylerte antisens ribosomale RNA prober syntetisert in vitro med T7 RNA polymerase. De biotinylerte rRNA prober hybridisert til de totale RNA. Hybridene tilfaller streptavidin-belagte perler og fjernet fra den totale RNA. Dette subtraksjon-basert protokoll fjerner effektivt både mygg og mikrobiell rRNA fra total RNA prøven. MRNA beriket prøven videreforedles for RNA forsterkning og RNA-Seq.

Protokollen inneholder tre deler: (1) utarbeidelse av metagenomic DNA maler for rRNA PCR, (2) etableringen av prøven spesifikke fange rRNA sonder, (3) reduksjon av rRNA fra total RNA fra subtraktiv hybridisering. Isolering av høykvalitets metagenomic DNA og RNA er essensielt for hele prosessen. Den modifiserte Meta-G-Nome DNA isolering protokollen gir høykvalitets metagenomic DNA fra mygg innvoller, som vist i figur 2. Det kan være utfordrende å isolere høy kvalitet total RNA fra mygg guts. Dette ...

Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq at JoVE.com

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

En ribosomalt RNA (rRNA) uttømming protokollen ble utviklet for å berike messenger RNA (mRNA) for RNA-seq av mygg gut metatranscriptome. Sample spesifikke rRNA sonder, som ble brukt til å fjerne rRNA via subtraksjon, ble opprettet fra den mygg og dets gut mikrober. Ytelse av protokollen kan resultere i fjerning av ca 90-99% av rRNA.

Nedbryting av ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transkripsjon og tildekking av Gaussia luciferase mRNA Etterfulgt av Jakten Cell Transfeksjon

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Substrat Generation for endonukleaser av CRISPR / Cas Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

RNA-seq Analyse av Transcriptomes i Thrombin-behandlet og Kontroll Menneskelig Pulmonal mikrovaskulær endotelceller

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Neste-generasjons sekvensering av 16S ribosomalt RNA Gene amplikonene

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En eksperimentell og bioinformatikk protokoll for RNA-seq Analyser av Photoperiodic Diapause i den asiatiske tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fysiologiske Recordings og RNA sekvensering av Gustatory vedheng av Yellow-feber Mosquito<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Chitosan / interfering RNA Nanopartikkel mediert genet Slå i Disease Vector mygglarver

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cellen spesifikk Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...