Name: depletion of ribosomal rna for mosquito gut metagenomic rna-seq
Uploaded: 2013-04-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH bidrag 1SC2GM092789-01A1, och MS var en forskaren i NMSU Howard Hughes Medical Institution Grundutbildning forskningsprogram. Videoen riktades och producerad av Amy Lanasa och samordnas av Dr Philip Lewis med Creative Media Institute i NMSU.

Tillvägagångssätt 1. Mygga Uppfödning <ol><li> Bakre mygga Anopheles gambiae G3 stam i en insectary vid 27,5 ° C med 80% luftfuktighet och 12:12 HR-cykeln av ljus / mörker. </li><li> Feed larver med marken kattmat med öljäst på förhållandet 1:1. </li><li> Feed vuxna myggor på möss blod vid dag 3 efter uppkomst för äggproduktion. </li></ol> 2. Mygga Gut Dissektion <ol><li> Autoklav dissekering verktyg (diabilder och pincett). </li><li> Samla 50...

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+the+Bemisia+tabaci+Transcriptome+Reveals+a+Highly+Diverse+Bacterial+Community+and+a+Robust+System+for+Insecticide+Resistance.">Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance.</a> PLoS One. 7, e35181 (2012).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+metatranscriptome+of+the+protistan+community+in+Coptotermes+formosanus+with+emphasis+on+the+lignocellulolytic+system.">Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system.</a> Genomics. 99, 246-255 (2012).</li><li>Gosalbes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+approach+to+analyze+the+functional+human+gut+microbiota.">Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota.</a> PLoS One. 6, e17447 (2011).</li><li>Urich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assessment+of+soil+microbial+community+structure+and+function+through+analysis+of+the+meta-transcriptome.">Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome.</a> PLoS One. 3, e2527 (2008).</li><li>Gilbert, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+large+numbers+of+novel+sequences+in+the+metatranscriptomes+of+complex+marine+microbial+communities.">Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities.</a> PLoS One. 3, e3042 (2008).</li><li>Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+deeply+sequenced+marine+microbial+metatranscriptome.">Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome.</a> ISME J. 5, 461-472 (2011).</li><li>Poretsky, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+day/night+metatranscriptomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+North+Pacific+subtropical+gyre.">Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre.</a> Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).</li><li>Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+activity+of+paddy+soil+bacterial+communities.">Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities.</a> Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).</li><li>Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+mRNA+from+soil.">Extraction of mRNA from soil.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+two+ribosomal+RNA+removal+methods+for+microbial+metatranscriptomics.">Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics.</a> Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).</li><li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+mRNA+purification+by+magnetic+capture-hybridization+method.">Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method.</a> Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).</li><li>Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+quantitative+analyses+of+a+universal+rRNA-subtraction+protocol+for+microbial+metatranscriptomics.">Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics.</a> ISME J. 4, 896-907 (2010).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PLoS One. 6, e24767 (2011).</li><li>Su, C., Sordillo, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+enrich+mRNA+from+total+prokaryotic+RNA.">A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA.</a> Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).</li><li>Gusmao, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-dependent+and+culture-independent+characterization+of+microorganisms+associated+with+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+(L.)+and+dynamics+of+bacterial+colonization+in+the+midgut.">Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut.</a> Acta Trop. 115, 275-281 (2010).</li><li>Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+identification+of+midgut+bacteria+from+field-caught+Anopheles+gambiae+sensu+lato+and+A.+funestus+mosquitoes+reveals+new+species+related+to+known+insect+symbionts.">16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).</li><li>Simon, C., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analyses:+past+and+future+trends.">Metagenomic analyses: past and future trends.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).</li><li>Wang, Y., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+fragments+in+bacterial+16S+rRNA+genes+and+primer+design+for+16S+ribosomal+DNA+amplicons+in+metagenomic+studies.">Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies.</a> PLoS One. 4, e7401 (2009).</li><li>Hunt, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+23S+rRNA+PCR+primers+for+use+in+phylogenetic+studies+of+bacterial+diversity.">Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).</li></ol>

En komplex mikrobiella bosatt i mygga tarmen ekosystem 14,16,17. Metatranscriptomic sekvensering (RNA-seq) kan avslöja kontextberoende funktionell information genom att fråga hela mikrobiella transkriptom 4,18. Tekniskt är oligo-d (T)-medierad anrikning av prokaryot mRNA inte tillämplig på grund av frånvaron av stabila poly (A) svansar budbärarna. Alternativt har rRNA utarmning använts för mRNA-anrikning. Här utvecklade vi en subtraktion-baserat protokoll för att tömma rRNA med rRNA son...

Nästa generations sekvensering teknik har kraftigt framåt metagenomik studie genom att bedöma Artsammansättning och genetisk funktionalitet i en mikrobiell samling. RNA-sekvensering (RNA-Seq) 1 kan kringgå kultur-baserade metoder för att undersöka mikrobiella metatranscriptomes i olika sammanhang 2-5. Ett stort hinder för mikrobiell RNA-seq är svårigheten att berika mRNA, som prokaryota mRNA inte stabilt polyadenyleras. Därför är oligo-d (T)-medierad budbärare anrikning inte tillämplig. Avlägsnande av riklig rRNA är ett alternativt tillvägagångssätt för att berika mRNA. Kommersiella rRNA utarmning kit, såsom Microexpress Bakteriell mRNA Anrikning sats (Ambion), RiboMinus Transkriptomanalys Isolation Kit (Bakterier) (Life Technologies), och mRNA-ONLY Prokaryot mRNA Isolation Kit (Epicentre) som företrädesvis bryter ned rRNA med ett exonukleas, har använts för avlägsnande rRNA 6-8. Men den infångningsprober i Microexpresseller RiboMinus är bra för att ta bort kända rRNA från typiska grampositiva och gramnegativa bakterier (se tillverkarens specifikationer), men mindre kompatibel med rRNA från okända mikrober. Följaktligen kan avlägsnandet vara mindre effektiva för metagenomic prover 8-10. Dessutom var mRNA överflöd trohet ifrågasättas när exonukleasbehandling tillämpades 11. Sammantaget var subtraktion-baserade rRNA utarmning mindre partisk och mer effektiva i mRNA-anrikning i metagenomic inställningar 10-13. Mygga tarmen rymmer en dynamisk mikrobiell gemenskap 14. Vi är intresserade av att karakterisera funktionen av mygga tarmen microbiome med RNA-Seq. I en RNA-prov isolerat från mygga inälvor, både mygga och mikrobiella RNA är närvarande. Här beskriver vi ett modifierat protokoll som ska användas samhället specifika rRNA sonder att effektivt bryter mygga och mikrobiell rRNA genom subtraktiv hybridisering. Den resulterande mRNAberikade prover är lämpliga för RNA-sekvens. Den totala arbetsflödet visas i figur 1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Meta-G-Nome 				DNA isolation kit</td>
 <td>Epicentre</td>
 <td>MGN0910</td>
 <td>Metagenomic 				DNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TriPure </td>
 <td>Roche</td>
 <td>11667165001</td>
 <td>Mdetagenomic 				RNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEGAscript 				T7 kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1334</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA probes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNaseZap</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9780</td>
 <td>RNase 				free working area </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-16-UTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11388908910</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-11-CTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4739205001</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin 				magnetic beads</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1420S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic 				separation rack</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1506S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy 				mini kit</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>74104</td>
 <td>Purification 				of subtracted RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free 				DNase Set</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>79254</td>
 <td>Removal 				DNA contamination </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 				RNA 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Gen 				PRO200 				Homogenizer</td>
 <td>PRO 				Scientific</td>
 <td>01-01200</td>
 <td>Mosquito 				gut tissue homogenization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NanoDrop 				1000 Spectrophotometer</td>
 <td>Thermo 				Scientific</td>
 <td></td>
 <td>DNA 				&amp; RNA quantitation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2100 				Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>G2940CA</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

depletion of ribosomal rna for mosquito gut metagenomic rna-seq

Mygga tarmen rymmer dynamiska mikrobiella samhällen i olika stadier av insektens livscykel. Karakterisering av den genetiska kapacitet och funktionalitet i tarmen samhället kommer att ge inblick i effekterna av tarmfloran på mygga livet egenskaper. Metagenomic RNA-Seq har blivit ett viktigt verktyg för att analysera transcriptomes från olika mikrober som finns i en mikrobiell gemenskap. Budbärar-RNA innefattar vanligen endast 1-3% av totalt RNA, medan rRNA utgör cirka 90%. Det är en utmaning att berika budbärar-RNA från en metagenomic mikrobiell RNA-prov eftersom de flesta prokaryota mRNA saknar stabila poly (A) svans. Detta förhindrar oligo-d (T) isolering medierad mRNA. Här beskriver vi ett protokoll som utnyttjar prov härlett rRNA fånga prober för att avlägsna rRNA från en metagenomic total RNA-prov. Till att börja med är både mygga och mikrobiella små och stora subenhet fragment rRNA amplifieras från en metagenomic gemenskap DNA-prov. Därefter kommunikapens specifika biotinylerade antisens ribosomalt RNA-prober syntetiseras in vitro med användning av T7 RNA-polymeras. De biotinylerade rRNA prober hybridiserades till totalt RNA. Hybriderna fångas av streptavidin-belagda pärlor och avlägsnas från totalt RNA. Detta subtraktion-baserat protokoll avlägsnar effektivt både mygg och mikrobiell rRNA från hela RNA-prov. MRNA berikade provet bearbetas vidare för RNA förstärkning och RNA-sekvens.

Protokollet innehåller tre delar: (1) beredning av metagenomic DNA mallar för rRNA PCR, (2) skapa prov prober fånga rRNA, (3) utarmning av rRNA från total RNA genom subtraktiv hybridisering. Isolering av hög kvalitet metagenomic DNA och RNA är nödvändig för hela processen. Den modifierade Meta-G-Nome DNA-isolering protokoll ger högkvalitativ metagenomic DNA från mygga inälvor, såsom visas i figur 2. Det kan vara svårt att isolera högkvalitativa total RNA från mygga inälvor. Detta är sa...

Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq at JoVE.com

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

En ribosomalt RNA (rRNA) utarmning protokoll utvecklades för att berika budbärar-RNA (mRNA) för RNA-punkter i mygga tarmen metatranscriptome. Exempel specifika rRNA sonder, som används för att avlägsna rRNA via subtraktion, skapades från mygga och dess mikrober gut. Utförande av protokollet kan resultera i avlägsnande av ungefär 90-99% av rRNA.

Utarmning av ribosomalt RNA för Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Storskaliga skärmar Metagenomic bibliotek

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

Protokoll för Mosquito Uppfödning (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transkription och begränsning av Gaussia Luciferas mRNA Följt av HeLa celltransfektion

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Substrat för skapandet endonukleaser av CRISPR / CAS Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

RNA-seq Analys av Transcriptomes i trombin behandlade och kontroll Human pulmonell mikrovaskulära endotelceller

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Nästa generations sekvensering av 16S ribosom RNA Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En experimentell och bioinformatik Protokoll för RNA-seq Analyser av fotoperiodisk diapaus i den asiatiska tigern Mosquito,<em&gt; Asiatisk tigermygga</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fysiologiska Inspelningar och RNA sekvensering av de smak bihang till Gula-febern Mosquito<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Chitosan / Störande RNA nanopartiklar Medierad geners uttryck i sjukdom Vector mygglarver

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cell-typspecifika epigenomet profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...